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[求助]
原味荧光杂交（FISH）细节求教 已有1人参与
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rt，楼主现在正在做FISH实验遇到了几个问题，想请教下各位同行。问题如下： 1. 原位杂交一般是有个带荧光的探针和DAPI复染，那请问在激光共聚焦上看的时候是选择荧光探针的激发和发射波长，还是说要包括DAPI的激发和发射波长，从而进行图片叠加呢？ 2. 像我们实验室激发波长最低是488nm，明显超过DAPI的340nm上限，那为什么我还能在激光共聚焦上看到有蓝色的部分？ 3. 用DAPI复染的目的是什么？是为了观察其他没携带探针的微生物吗？如果是，那可否不进行复染呢？ |
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Davidzjy
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【答案】应助回帖
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从原理的角度讲 FISH的探针通常标记一个比较小的片段 这种荧光信号太小 在低倍镜下很难找 DAPI这类复染剂的作用就是显示细胞核位置的 你看复染剂的英文counterstain 其中前缀counter-表示“相反的” stain表示“染色;染料” 一般的显微操作流程 也是先在低倍镜下用DAPI找到细胞对好焦 然后切到高倍镜 定下视野再切换到探针对应的通道来观察信号 至于最后一个问题 个人理解LZ的意思是问为什么肉眼能看到蓝光打在玻片上——因为DAPI的激发光属于紫外线范围 而滤光片会保留光谱上与激发光相近波长的光线 因此在光谱上与紫外线相邻的可见光（蓝紫色光）就被漏过了 一个类似的例子 实验室、医院里常用的紫外消毒灯在工作时 肉眼看也是发蓝紫色光 |
4楼2023-01-24 12:36:05
恒意赛teh 
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2楼2023-01-15 15:08:41
恒意赛teh
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3楼2023-01-15 15:10:11
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十分感谢您的回复。另外我还有个小问题想再请教下：就是我下面A图是杂交的情况，而C图是无义杂交（没杂交的），就是我不太明白这两个有什么差别？明明都有染色，只是一个有亮点，一个没有，但这样会影响我们找到目标微生物吗？ 发自小木虫Android客户端 |
5楼2023-01-28 19:25:38