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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR产物直接测序？
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fanxing001

铜虫 (小有名气)

[交流] PCR产物直接测序？

各位，我想筛选人肠道中的菌，我想用体外培养的方式将各种细菌的单菌落分开，然后选择通用引物，进行16s rDNA的PCR，以便确定各细菌归属，我的问题是：PCR后能否不经过转到基因工程菌的方式，直接将PCR产物测序？如果可行的话，对论文的档次是否存在影响？谢谢

[ Last edited by amisking on 2009-9-17 at 12:55 ]
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1楼 2009-09-17 10:49:46
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bioxixi

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
amisking(金币+4,VIP+0): 9-17 11:24
PCR产物很少直接测序，因为会存在错配，测序时会有多峰的，不准确。我不知道你为什么要直接测序，转到基因工程菌里会有影响吗？如果没有可以考虑测单克隆，比较准确。不过测序公司是提供直接测序的。我不是很了解对文章的影响，你查查看吧
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2楼2009-09-17 11:12:48
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yaoyl0679

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
16S 较长，可以直接测序，一把可以测出1400bp左右，够比对确定到属
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3楼2009-09-17 11:20:17
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tangtl

木虫 (正式写手)

小木虫潜水者
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可以连接T载体直接测序。单向测序有效结果900bp左右 可以双向测。
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4楼2009-09-17 12:11:57
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孔乙己

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
真菌鉴定很多都不做T载体连接，直接测序，影响不大，对比对出入也不大，我亲自试过的，英竣测序就比较好，生工一般
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愿大家共同进步
5楼2009-09-17 12:16:06
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yangym1123

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可以直接测序啊！华大基因也不错呢！
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6楼2009-09-17 12:54:44
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xuezhen

银虫 (小有名气)
学习中！
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7楼2009-09-17 13:03:53
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我觉得PCR产物直接测序的话是不好或者不行的，因为在PCR产物中，正确是序列只占一部分，仍然存在很多碱基错配的序列，虽然在整体上占的比例并不是很多，毕竟测序的话还是需要一定纯度及浓度的。我觉得可以做个TA克隆后再测序。
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8楼2009-09-17 13:46:35
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)
学习了顶一下
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9楼2009-09-17 14:07:34
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spiderboy

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
直接测序是完全可以的，不过要看你是做什么了。。。比如你这个，我认为直接测不妥，因为你要的有效序列能越长则越好，因为你肯定要做序列比对，做分析或者进化树的，所以需要你扩出来的片段的全序列。。所以只能连到载体上测，做平连或TA克隆都可以。。。。PCR测序中，靠近引物的几十个bp是测不出来的，所以PCR测时测不出全序列的。。。这当然会影响到你的实验说服力了。。
      如果你只需要片段中部的一段序列，那用PCR产物直接测是可以的。不过要注意PCR产物切胶和回收要做干净。
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10楼2009-09-17 20:27:26
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