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fanxing001

铜虫 (小有名气)

[交流] PCR产物直接测序?

各位,我想筛选人肠道中的菌,我想用体外培养的方式将各种细菌的单菌落分开,然后选择通用引物,进行16s rDNA的PCR,以便确定各细菌归属,我的问题是:PCR后能否不经过转到基因工程菌的方式,直接将PCR产物测序?如果可行的话,对论文的档次是否存在影响?谢谢

[ Last edited by amisking on 2009-9-17 at 12:55 ]
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bioxixi

木虫 (著名写手)

★ ★ ★ ★
amisking(金币+4,VIP+0): 9-17 11:24
PCR产物很少直接测序,因为会存在错配,测序时会有多峰的,不准确。我不知道你为什么要直接测序,转到基因工程菌里会有影响吗?如果没有可以考虑测单克隆,比较准确。不过测序公司是提供直接测序的。我不是很了解对文章的影响,你查查看吧
2楼2009-09-17 11:12:48
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yaoyl0679

金虫 (正式写手)


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16S 较长,可以直接测序,一把可以测出1400bp左右,够比对确定到属
3楼2009-09-17 11:20:17
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tangtl

木虫 (正式写手)

小木虫潜水者


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可以连接T载体直接测序。单向测序有效结果900bp左右 可以双向测。
4楼2009-09-17 12:11:57
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孔乙己

银虫 (正式写手)


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真菌鉴定很多都不做T载体连接,直接测序,影响不大,对比对出入也不大,我亲自试过的,英竣测序就比较好,生工一般
愿大家共同进步
5楼2009-09-17 12:16:06
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yangym1123

木虫 (小有名气)


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可以直接测序啊!华大基因也不错呢!
6楼2009-09-17 12:54:44
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xuezhen

银虫 (小有名气)

学习中!
7楼2009-09-17 13:03:53
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)


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我觉得PCR产物直接测序的话是不好或者不行的,因为在PCR产物中,正确是序列只占一部分,仍然存在很多碱基错配的序列,虽然在整体上占的比例并不是很多,毕竟测序的话还是需要一定纯度及浓度的。我觉得可以做个TA克隆后再测序。
8楼2009-09-17 13:46:35
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)

学习了顶一下
9楼2009-09-17 14:07:34
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spiderboy

金虫 (正式写手)


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直接测序是完全可以的,不过要看你是做什么了。。。比如你这个,我认为直接测不妥,因为你要的有效序列能越长则越好,因为你肯定要做序列比对,做分析或者进化树的,所以需要你扩出来的片段的全序列。。所以只能连到载体上测,做平连或TA克隆都可以。。。。PCR测序中,靠近引物的几十个bp是测不出来的,所以PCR测时测不出全序列的。。。这当然会影响到你的实验说服力了。。
      如果你只需要片段中部的一段序列,那用PCR产物直接测是可以的。不过要注意PCR产物切胶和回收要做干净。
10楼2009-09-17 20:27:26
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