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dummy’eye

新虫 (小有名气)

[交流] 求助 已有2人参与

有人做过用重叠延伸pcr连接两段基因吗?我的两基因重叠pcr后,目的条带很亮,还没什么杂带。我胶回收后,再用两段引物扩增,怎么都扩不出来了

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shuaibia6

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
可以先尝试测序,看看是不是你想要的目的条带
2楼2022-12-12 09:03:22
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dummy’eye

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by shuaibia6 at 2022-12-12 09:03:22
可以先尝试测序,看看是不是你想要的目的条带

测了序,连是连上了,但是有一堆突变

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3楼2023-01-10 15:27:06
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dummy’eye

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by dummy’eye at 2023-01-10 15:27:06
测了序,连是连上了,但是有一堆突变
...

用的还是高保真酶,诺唯赞的

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4楼2023-01-10 15:28:49
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shuaibia6

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by dummy’eye at 2023-01-10 15:27:06
测了序,连是连上了,但是有一堆突变
...

针对错配位置重新设计引物以纠错
5楼2023-01-10 16:44:45
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dummy’eye

新虫 (小有名气)

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5楼: Originally posted by shuaibia6 at 2023-01-10 16:44:45
针对错配位置重新设计引物以纠错...

你好,我不太明白。两基因都是胶回收得来。连接后测序结果显示只有一个基因上有突变,有很多。跟引物好像没啥关系吧,是延伸过程中错配了

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6楼2023-01-11 11:57:39
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shuaibia6

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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6楼: Originally posted by dummy’eye at 2023-01-11 11:57:39
你好,我不太明白。两基因都是胶回收得来。连接后测序结果显示只有一个基因上有突变,有很多。跟引物好像没啥关系吧,是延伸过程中错配了
...

如果不懂建议交给专业的人员,或者请教你们实验室有经验的前辈
7楼2023-01-11 13:50:52
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澜沧的爱

新虫 (小有名气)


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两基因拼接的时候,减少一下循环数试试,20个循环基本就可以了。循环越多,可能发生的错配越多。诺唯赞的phant高保真酶还可以,我之前拼接也是用它

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8楼2023-02-01 11:56:44
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