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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 测序问题求救
汕头大学海洋科学接受调剂
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695

木虫 (职业作家)

[交流] 测序问题求救

我现在有个问题想跟大家讨论下，我把我的片段克隆到了pGEM T载体上，酶切验证了是我要的菌落，但是PCR的时候出现了问题，单正向引物能扩出多条带，而正反向引物合在一起只有一条目的带(见图：图中1-2是 M13F-M13R 重复；3-4是M13F only，现在我要是正向测序就遇到困难了，请大家给我指点迷津！

PCR程序：
95   3min

95  1min
60  1min
72   1min
30cycles

72 10min
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1楼 2009-09-13 18:15:26
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 9-13 19:31
把退火温度提高到65度，做PCR就可以了，至于测序可以换引物，你若找不到合适的，把载体的序列给公司，给他说要设计引物测插入片段，就可以了，或者反向测通就不需要正向测序

[ Last edited by gastrodia on 2009-9-13 at 19:06 ]
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2楼2009-09-13 19:04:14
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695

木虫 (职业作家)
恩，多谢楼上了，我这就照您的意思，做个PCR再验证下看看怎么回事！非常感激gastrodia  兄
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3楼2009-09-13 19:35:57
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yxhan7113

金虫 (小有名气)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 9-13 21:18
梯度PCR试试合适温度吧
测序通用引物就可以
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4楼2009-09-13 20:24:15
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695

木虫 (职业作家)
恩，多谢指点，不甚感激
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5楼2009-09-13 21:09:13
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xuezhen

银虫 (小有名气)
学习下！
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6楼2009-09-14 09:05:14
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liganghua

铁杆木虫 (著名写手)

露天使
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你可以根据引物的序列，大概计算出退火温度（根据合成的引物中的GC含量可以用公式计算出退火温度,引物的一个重要参数是熔解温度【Tm】。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。）

）
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华露花苑回廊
7楼2009-09-14 09:15:29
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heismeng

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我想问下你为什么要做这个PCR呢 目的是什么
谢谢
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8楼2009-09-14 09:29:07
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zxhong

金虫 (正式写手)
学习下！
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9楼2009-09-14 13:52:14
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695

木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by liganghua at 2009-9-14 09:15:
你可以根据引物的序列，大概计算出退火温度（根据合成的引物中的GC含量可以用公式计算出退火温度,引物的一个重要参数是熔解温度【Tm】。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火 ...

THANKS VERY MUCH!
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10楼2009-09-14 14:40:59
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