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695

木虫 (职业作家)

[交流] 测序问题求救

我现在有个问题想跟大家讨论下,我把我的片段克隆到了pGEM T载体上,酶切验证了是我要的菌落,但是PCR的时候出现了问题,单正向引物能扩出多条带,而正反向引物合在一起只有一条目的带(见图:图中1-2是 M13F-M13R 重复;3-4是M13F only,现在我要是正向测序就遇到困难了,请大家给我指点迷津!

PCR程序:
95   3min

95  1min
60  1min
72   1min
30cycles

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695

木虫 (职业作家)

引用回帖:
Originally posted by liganghua at 2009-9-14 09:15:
你可以根据引物的序列,大概计算出退火温度(根据合成的引物中的GC含量可以用公式计算出退火温度,引物的一个重要参数是熔解温度【Tm】。这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火 ...

THANKS VERY MUCH!
10楼2009-09-14 14:40:59
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gastrodia

金虫 (正式写手)

★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 9-13 19:31
把退火温度提高到65度,做PCR就可以了,至于测序可以换引物,你若找不到合适的,把载体的序列给公司,给他说要设计引物测插入片段,就可以了,或者反向测通就不需要正向测序

[ Last edited by gastrodia on 2009-9-13 at 19:06 ]
2楼2009-09-13 19:04:14
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695

木虫 (职业作家)

恩,多谢楼上了,我这就照您的意思,做个PCR再验证下看看怎么回事!非常感激gastrodia  兄
3楼2009-09-13 19:35:57
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yxhan7113

金虫 (小有名气)


司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 9-13 21:18
梯度PCR试试合适温度吧
测序通用引物就可以
4楼2009-09-13 20:24:15
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