应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 测序问题求救
111/2返回列表12下一页
查看: 917  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

695

木虫 (职业作家)

[交流] 测序问题求救

我现在有个问题想跟大家讨论下，我把我的片段克隆到了pGEM T载体上，酶切验证了是我要的菌落，但是PCR的时候出现了问题，单正向引物能扩出多条带，而正反向引物合在一起只有一条目的带(见图：图中1-2是 M13F-M13R 重复；3-4是M13F only，现在我要是正向测序就遇到困难了，请大家给我指点迷津！

PCR程序：
95   3min

95  1min
60  1min
72   1min
30cycles

72 10min
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2009-09-13 18:15:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gastrodia

金虫 (正式写手)
★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 9-13 19:31
把退火温度提高到65度，做PCR就可以了，至于测序可以换引物，你若找不到合适的，把载体的序列给公司，给他说要设计引物测插入片段，就可以了，或者反向测通就不需要正向测序

[ Last edited by gastrodia on 2009-9-13 at 19:06 ]
赞一下(10人) 回复此楼
2楼2009-09-13 19:04:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

695

木虫 (职业作家)
恩，多谢楼上了，我这就照您的意思，做个PCR再验证下看看怎么回事！非常感激gastrodia  兄
赞一下 回复此楼
3楼2009-09-13 19:35:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yxhan7113

金虫 (小有名气)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 9-13 21:18
梯度PCR试试合适温度吧
测序通用引物就可以
赞一下(10人) 回复此楼
4楼2009-09-13 20:24:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

695

木虫 (职业作家)
恩，多谢指点，不甚感激
赞一下 回复此楼
5楼2009-09-13 21:09:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xuezhen

银虫 (小有名气)
学习下！
回复此楼
6楼2009-09-14 09:05:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liganghua

铁杆木虫 (著名写手)

露天使
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你可以根据引物的序列，大概计算出退火温度（根据合成的引物中的GC含量可以用公式计算出退火温度,引物的一个重要参数是熔解温度【Tm】。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。）

）
赞一下(1人) 回复此楼
华露花苑回廊
7楼2009-09-14 09:15:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

heismeng

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我想问下你为什么要做这个PCR呢 目的是什么
谢谢
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2009-09-14 09:29:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zxhong

金虫 (正式写手)
学习下！
回复此楼
9楼2009-09-14 13:52:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

695

木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by liganghua at 2009-9-14 09:15:
你可以根据引物的序列，大概计算出退火温度（根据合成的引物中的GC含量可以用公式计算出退火温度,引物的一个重要参数是熔解温度【Tm】。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火 ...

THANKS VERY MUCH!
赞一下 回复此楼
10楼2009-09-14 14:40:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 695 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +10 majunge000 2026-08-10 13/650 2026-08-15 12:26 by hanpeng972
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 HFw0lei2R37i 2026-08-14 9/450 2026-08-15 11:33 by KxMI1BYBxWX1
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +6 Ldrop2023 2026-08-13 6/300 2026-08-15 10:09 by tuanggou
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 k0dTPqJtl0jt 2026-08-14 5/250 2026-08-15 04:45 by 4wMiSEwB6436
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 7lpolszZVXgi 2026-08-14 5/250 2026-08-15 04:41 by 4wMiSEwB6436
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 HFw0lei2R37i 2026-08-14 4/200 2026-08-15 04:17 by 4wMiSEwB6436
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 HFw0lei2R37i 2026-08-14 5/250 2026-08-15 00:16 by 4wMiSEwB6436
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 22/1100 2026-08-14 23:45 by Noways
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[基金申请] 奇怪，两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +8 布布和一二 2026-08-10 11/550 2026-08-14 14:58 by Equinoxhua
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +23 Lanmanbaby 2026-08-09 37/1850 2026-08-14 13:40 by Equinoxhua
[基金申请] FileCode能看出啥？ +10 要乐观耀哥 2026-08-10 32/1600 2026-08-14 09:37 by 要乐观耀哥
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +10 家与远方 2026-08-10 15/750 2026-08-14 02:08 by 绵羊哥哥
[文学芳草园] 阿姨 +4 汪汪锅 2026-08-09 4/200 2026-08-13 19:43 by arzu_hma
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 帮忙看看fileCode +7 wwncly 2026-08-10 13/650 2026-08-11 19:36 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭