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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 大肠杆菌原核表达，菌液直接SDS-PAGE跑不出来条带，求助
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SuYuo

铁虫 (小有名气)

[求助] 大肠杆菌原核表达，菌液直接SDS-PAGE跑不出来条带，求助 已有2人参与

最近在做原核表达，大肠杆菌诱导后做SDS-PAGE，其中菌液直接跑胶上个月还能做出来，突然有一天跑不出来了，怀疑是自己操作问题。
但是超声后的上清依然有目的蛋白表达，请问各位是什么原因？

我的样品处理是这样的：
1 取诱导后菌液，8000g5min离心，弃上清，PBS重悬再8000g5min离心，弃上清；
2 沉淀用25%原体积的裂解buffer重悬后，+蛋白上样buffer，95℃煮沸5min，12000g离心2min，取上清上样
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12
1楼 2022-08-17 20:02:39
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SuYuo

铁虫 (小有名气)
大肠杆菌原核表达，菌液直接SDS-PAGE跑不出来条带，求助

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12
2楼2022-08-17 20:05:06
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SuYuo

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by SuYuo at 2022-08-17 20:05:06

目的条带就是14kDa左右，很明显超声后的上清液有表达，但是菌液直接跑胶完全看不到

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12
3楼2022-08-17 20:06:40
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高飞雄

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by SuYuo at 2022-08-17 20:06:40
目的条带就是14kDa左右，很明显超声后的上清液有表达，但是菌液直接跑胶完全看不到
...

你确认是不是把上清和诱导后的搞混了
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4楼2022-08-18 14:23:26
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SuYuo

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 高飞雄 at 2022-08-18 14:23:26
你确认是不是把上清和诱导后的搞混了...

不会的，我跑过不下5遍。

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5楼2022-08-19 16:04:03
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Eleshark

新虫 (初入文坛)
看图，很可能是你超声的时候降解光了。

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6楼2022-08-19 22:41:02
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SuYuo

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Eleshark at 2022-08-19 22:41:02
看图，很可能是你超声的时候降解光了。

我是菌液直接跑胶，扫不出来。
菌体超声后的上清是有的，我加了蛋白酶抑制剂。

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12
7楼2022-08-20 22:20:13
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NineI

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by SuYuo at 2022-08-20 22:20:13
我是菌液直接跑胶，扫不出来。
菌体超声后的上清是有的，我加了蛋白酶抑制剂。
...

没做过菌液直接跑胶哎，能请教下怎么做嘛，正好最近在做蛋白
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8楼2022-08-25 16:03:38
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SuYuo

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
fuyuandj86: 金币+10, 鼓励交流 2022-09-10 13:35:29
引用回帖:
8楼: Originally posted by NineI at 2022-08-25 16:03:38
没做过菌液直接跑胶哎，能请教下怎么做嘛，正好最近在做蛋白...

我的方法可能有点问题，我跟你说一下吧，作为参考。
将培养后离心收集的沉淀用1/5体积的裂解液(LE buffer)重悬，和正常蛋白样品处理方法一样，菌液100ul+25ul蛋白上样buffer，95℃煮10分钟，12000离心1min，取上清上样。

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9楼2022-08-29 17:06:38
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NineI

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by SuYuo at 2022-08-29 17:06:38
我的方法可能有点问题，我跟你说一下吧，作为参考。
将培养后离心收集的沉淀用1/5体积的裂解液(LE buffer)重悬，和正常蛋白样品处理方法一样，菌液100ul+25ul蛋白上样buffer，95℃煮10分钟，12000离心1min，取上清 ...

好的，十分感谢！

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10楼2022-09-02 13:12:31
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