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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助，毕赤酵母表达蛋白
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ZZZZ0929

新虫 (小有名气)

[求助] 求助，毕赤酵母表达蛋白

求助大家，想要两个基因到入毕赤酵母进行表达，实验室没有基础，想求助以下问题

1.质粒线性化内切酶的选择：
按照文献上选择，质粒1内切酶在5 AOX1位点酶切，质粒2在5 AOX1+目的基因酶切。是否改变第二个质粒的酶切位点即可（在5 AOX1处、不在目的基因处）。
是否需要考虑，两个基因整合到毕赤酵母基因组不同位点？

2.毕赤酵母化学转化法是否可行？需要质粒多少ug合适？
电穿孔仪货期要3-4月，且贵。查到之前用Licl/PEG3350，可以嘛。质粒1大概有4 ug，质粒2 15.6 ug
培养到OD多少合适，看到有0.8-1 有1-1.2 1.3-1.5

3.毕赤酵母PCR阳性克隆筛选：
引物是否找载体的通用测序引物就行？查到毕赤酵母破壁后可以直接进行PCR，不用提取基因组DNA，这个信息对吗；

4.载体抗性和筛选：
质粒1是博来霉素抗性，质粒2是Kana/Amp抗性，如果两个均整合成功，是不是之后用Kana就行，还是要再加上博来霉素真菌抗生素呢
打算一个用组氨酸缺陷培养基筛选；一个用博来霉素筛选。查到可以依靠博来霉素浓度递增来筛选拷贝数多的菌株，那第一个要怎么筛选呢

4.SG-His培养基是直接买现成的比较好嘛？还是买YNB自己配？

组内人都已经问过，所以上网求助，谢谢大家
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1楼 2022-08-10 14:42:13
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匿名

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2楼2022-08-10 20:32:01
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ZZZZ0929

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 二元加油 at 2022-08-10 20:32:01
1可以插入到不同位置2.建议电转，划转效率低很多3需要用裂解液裂解在做pcr4用缺陷和博来霉素，多拷贝就是增加浓度

收到，谢谢！不知道怎么送金币，稍等

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3楼2022-08-11 13:41:11
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匿名

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4楼2022-08-11 13:57:23
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