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[求助]
求助，毕赤酵母表达蛋白
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求助大家，想要两个基因到入毕赤酵母进行表达，实验室没有基础，想求助以下问题 1.质粒线性化内切酶的选择： 按照文献上选择，质粒1内切酶在5 AOX1位点酶切，质粒2在5 AOX1+目的基因酶切。是否改变第二个质粒的酶切位点即可（在5 AOX1处、不在目的基因处）。 是否需要考虑，两个基因整合到毕赤酵母基因组不同位点？ 2.毕赤酵母化学转化法是否可行？需要质粒多少ug合适？ 电穿孔仪货期要3-4月，且贵。查到之前用Licl/PEG3350，可以嘛。质粒1大概有4 ug，质粒2 15.6 ug 培养到OD多少合适，看到有0.8-1 有1-1.2 1.3-1.5 3.毕赤酵母PCR阳性克隆筛选： 引物是否找载体的通用测序引物就行？查到毕赤酵母破壁后可以直接进行PCR，不用提取基因组DNA，这个信息对吗； 4.载体抗性和筛选： 质粒1是博来霉素抗性，质粒2是Kana/Amp抗性，如果两个均整合成功，是不是之后用Kana就行，还是要再加上博来霉素真菌抗生素呢 打算一个用组氨酸缺陷培养基筛选；一个用博来霉素筛选。查到可以依靠博来霉素浓度递增来筛选拷贝数多的菌株，那第一个要怎么筛选呢 4.SG-His培养基是直接买现成的比较好嘛？还是买YNB自己配？ 组内人都已经问过，所以上网求助，谢谢大家 |
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