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菜鸡咕噜

新虫 (初入文坛)

[交流] 研二菜鸡求助,感觉毕不了业了,求助 已有8人参与

我做的是小分子蛋白的表达,我质粒确认是转进去了的,我把诱导后的菌体拿去做了pcr,有正确的目的条带。但是破碎菌体后的蛋白没有抑菌活性,(该蛋白是一种抑菌的小分子肽)200bp左右,我的条件是 卡那霉素0.4mg/mL,IPTG是0.4mM,16℃200 rpm 16h,加诱导剂时的菌液OD600是0.6。我想问下这种问题出在哪里呀,感觉自己都毕不了业了。希望大家能给点建议吧,感谢各位!

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yandz680717

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
换几个不同的表达宿主试一下

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7楼2022-06-29 04:57:29
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花輪君

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 菜鸡咕噜 at 2022-06-27 10:25:14
可以问下,该怎么做才可以正常表达
...

不知道你这个蛋白是完全全新的还是说有类似报道但你们发现了未报道的活性,如果有已经报道的可以试下别人做过的载体,如果是全新的可以尝试多做几种表达载体。我不是这个领域的,多和导师讨论一下可能好一些,有时候自己弄很容易陷入误区。

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4楼2022-06-27 21:20:01
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嚯嚯哈嘿19

铜虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
菌P后即使条带正确也应该送去测序确定一下。还可以做一下wb检测。如果是对的但还是没有活性,可以更改一下载体比如23a载体、28a载体,或者换一下宿主细胞大肠杆菌或者酵母。
8楼2022-07-01 11:00:03
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花輪君

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
蛋白没有活性也许是表达出的蛋白没有正确的功能折叠或者一些修饰?

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2楼2022-06-27 08:34:35
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流水青苔

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
PCR目的条带回收,拿去测序加以确认;确保破碎菌体回收的蛋白是目的蛋白且没有变性;抑菌蛋白和诱导的菌体有没有冲突等等可能问题和老师请教逐一排除。
5楼2022-06-28 10:55:35
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天天进步啊

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你不问导师,说明你导师大概率是个菜鸡,那么你就只剩下一条路:问师兄师姐
分子筛、分子动力学模拟,有问题可咨询我的知乎主页 https://www.zhihu.com/people/rao777
9楼2022-07-01 14:54:10
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普通回帖

菜鸡咕噜

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 花輪君 at 2022-06-27 08:34:35
蛋白没有活性也许是表达出的蛋白没有正确的功能折叠或者一些修饰?

可以问下,该怎么做才可以正常表达

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3楼2022-06-27 10:25:14
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菜鸡咕噜

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 流水青苔 at 2022-06-28 10:55:35
PCR目的条带回收,拿去测序加以确认;确保破碎菌体回收的蛋白是目的蛋白且没有变性;抑菌蛋白和诱导的菌体有没有冲突等等可能问题和老师请教逐一排除。

谢谢

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6楼2022-06-28 20:12:48
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SuYuo

铁虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
这个目的肽如果本身是真核生物的序列,那你用原核的大肠杆菌表达出来大概率就是没有活性的,没经过高尔基体正确的加工与折叠,形成有效的结构。
另外破碎后的菌体跑胶有目的大小的条带吗?有没有区分蛋白是可溶性表达还是包涵体
12
10楼2022-09-07 10:44:29
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