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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR扩增条件摸索
汕头大学海洋科学接受调剂
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doris0520

金虫 (小有名气)

[交流] PCR扩增条件摸索

本人用PUC19的模板扩增100bp片段，以前扩的都很好，最近突然就扩不出来了，没有100bp带，而且条带都是弥散的。后来将酶量减少，能扩出来了，但是第二天同样的条件又没有结果了（没有100bp片段且条带弥散），请教一下高手到底是什么原因？
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1楼 2009-09-10 09:06:59
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
......诡异，建议LZ发BB攒人品。

考虑一下是不是模板的问题，比如反复冻融导致模板降解了。也许你那个弥散的条带是引物二聚体？
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2楼2009-09-10 10:26:22
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doris0520

金虫 (小有名气)
我的模板是新配的第一次还好用，-20度冻存一晚第二天用应该没关系吧   弥散的条带在400-800bp左右，比引物二聚体大，应该不是
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3楼2009-09-10 16:13:48
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yxx41

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 9-10 20:16
这个确实有够诡异啊。
要不来次彻底的清理，工作地点该灭菌的灭菌，该清理的清理。提取DNA的试剂重新配制，然后再试试啊。
我以前也是这样啊，然后彻底从头再来，现在结果还是比较稳定。
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内事不决问百度，外事不决问Google，横批：wikipedia
4楼2009-09-10 18:59:00
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spiderboy

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
出现这种情况可以说你的扩这个的PCR条件还不够优化，所以会出现结果不稳定的情况。。这种现象不诡异，确实是因为条件还不是最好的，所以实验中还有很多因素会成为决定实验结果的主要因素，比如操作多振荡了一下，等等。。
所以，仍需再摸下条件。。你的体系和反应条件温度是怎样的？
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5楼2009-09-10 21:00:11
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kitty8682

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我前一段时间也遇到过类似的情况，一直找不到是什么原因，后来把模板还有所有PCR用的东西都换了，就p出来了
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6楼2009-09-11 08:34:57
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doris0520

金虫 (小有名气)
同样的试剂，我换了个可以扩500bp的引物和100bp的引物一起进行PCR，在同一个机器上用相同的程序运行，结果500bp的条带非常好，100bp的还是全部弥散。
我目前已经换过很多个模板而且稀释不同倍数，改变酶的加入量，使用不同的酶，改变引物加入量，结果都不行，我都快疯了。。。。
体系如下：
dNTP（10nM） 1ul
引物F          2ul
引物R              2ul
模板           1ul
Taq                 1ul
10*bf              5ul
水          至50ul
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7楼2009-09-11 09:00:15
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doris0520

金虫 (小有名气)
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72                 30s
72                10min
38 cycles
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8楼2009-09-11 09:02:00
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112976553

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
含镁的酶？退火温度有没有尝试提高几度呢？
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9楼2009-09-11 10:01:46
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doris0520

金虫 (小有名气)
buffer里就有镁离子，引物本来设计的退火温度大概是40多度，现在用54度，再高可能就扩不出来了吧
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10楼2009-09-11 10:05:06
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