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doris0520

金虫 (小有名气)

[交流] PCR扩增条件摸索

本人用PUC19的模板扩增100bp片段,以前扩的都很好,最近突然就扩不出来了,没有100bp带,而且条带都是弥散的。后来将酶量减少,能扩出来了,但是第二天同样的条件又没有结果了(没有100bp片段且条带弥散),请教一下高手到底是什么原因?
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doris0520

金虫 (小有名气)

我的模板是新配的第一次还好用,-20度冻存一晚第二天用应该没关系吧   弥散的条带在400-800bp左右,比引物二聚体大,应该不是
3楼2009-09-10 16:13:48
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doris0520

金虫 (小有名气)

同样的试剂,我换了个可以扩500bp的引物和100bp的引物一起进行PCR,在同一个机器上用相同的程序运行,结果500bp的条带非常好,100bp的还是全部弥散。
我目前已经换过很多个模板而且稀释不同倍数,改变酶的加入量,使用不同的酶,改变引物加入量,结果都不行,我都快疯了。。。。
体系如下:
dNTP(10nM) 1ul
引物F          2ul
引物R              2ul
模板           1ul
Taq                 1ul
10*bf              5ul
水          至50ul
7楼2009-09-11 09:00:15
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doris0520

金虫 (小有名气)

94                  3min
94                 30s
54                  30s
72                 30s
72                10min
38 cycles
8楼2009-09-11 09:02:00
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doris0520

金虫 (小有名气)

buffer里就有镁离子,引物本来设计的退火温度大概是40多度,现在用54度,再高可能就扩不出来了吧
10楼2009-09-11 10:05:06
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