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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 基因工程，构建表达质粒
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树下的apple

新虫 (初入文坛)

[交流] 基因工程，构建表达质粒 已有3人参与

请问大佬们，构建表达质粒时，为验证目的片段与载体是否连接上，用NEB的T4连接酶连接后做了转化、菌液PCR可以扩出目的大小条带，提质粒后仍用NEB的酶做双酶切（50μl体系），质粒1μg定量，两种酶各用1μl, 37摄氏度切了7h也最终也没切开会是什么原因呢？用该质粒去扩目的片段也可以扩出来。酶加少了吗？
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1楼 2022-05-25 09:51:11
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树下的apple

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hoooobby at 2022-05-26 15:36:59
做酶切酶连的时候，载体和片段酶切时间过长，会造成粘性末端破坏，连接上后，发现就切不开了
可以扩出来  大小也对    去测序  可能就会丢失几个剪辑
我遇到过
所以一般酶切不超过1h

谢谢您给出的建议。想问问您做酶切或连接用的哪家公司的酶呢？
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4楼2022-05-29 22:48:22
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隐约

铁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
酶失活了？有甲基化修饰？
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2楼2022-05-25 10:00:32
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hoooobby

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
做酶切酶连的时候，载体和片段酶切时间过长，会造成粘性末端破坏，连接上后，发现就切不开了
可以扩出来  大小也对    去测序  可能就会丢失几个剪辑
我遇到过
所以一般酶切不超过1h
赞一下 回复此楼
一直科研狗快乐又自由！！！
3楼2022-05-26 15:36:59
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画画的bb

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 树下的apple at 2022-05-29 22:48:22
谢谢您给出的建议。想问问您做酶切或连接用的哪家公司的酶呢？...

FUBIO
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15371815028
5楼2022-05-30 10:33:36
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