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lxjwishes

银虫 (正式写手)

[交流] 请教关于Northern blot 中需要注意的 环节

最近刚开始做Northern blot准备
所用的试剂盒是Dig DNA Labeling and Detection kit
cat.No.11093657910

对于其中的一些操作还是有些不清楚,请大家指教:
part1:首先是RNA电泳
这个步骤中所需要的电泳缓冲液,上样缓冲液,在配制的时候是不是必须都用灭菌的DEPC水处理过,
就是配制的时候先把瓶子,量筒,烧杯,玻璃棒烘好,DEPC水灭好,再进行配制?
还有电泳槽和制胶的东西是怎么处理的?

Part2:转膜
变性后的RNA进行转膜就不需要像southern一样变性,中和了,转膜的时候,胶是和尼龙膜紧密接触的,那么尼龙膜,whatmann滤纸需要去除RNAase么?紫外交联后还要继续防止降解么?

part3:杂交与显影
我用的探针是DNA探针,后面的操作是否就如southern ?

[ Last edited by 350784478 on 2009-9-9 at 09:22 ]
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pleasemywings,flymeaway.
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xhlxhl

木虫 (正式写手)


lxjwishes(金币+1,VIP+0): 10-14 10:13
Part2:转膜
不用变性吧,RNA单链,在20*SSC洗洗就好了,尼龙膜,whatmann滤纸不需要去除RNAase的(也没法除的,呵呵),交联以后就安全多了,不用特别注意了
3楼2009-09-09 01:34:07
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xhlxhl

木虫 (正式写手)

★ ★
lxjwishes(金币+1):谢谢参与
lxjwishes(金币+1,VIP+0): 10-14 10:13
part1 就是那么配置的,电泳槽和制胶好好用去污剂刷刷,没问题的
2楼2009-09-09 01:25:31
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xhlxhl

木虫 (正式写手)


lxjwishes(金币+1,VIP+0): 10-14 10:14
part3:杂交与显影
这一步完全如southern了
4楼2009-09-09 01:35:02
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xhlxhl

木虫 (正式写手)


lxjwishes(金币+1,VIP+0):谢谢 9-13 19:44
补充part1 :有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温10min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干
5楼2009-09-09 01:43:10
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