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一芯向南新虫 (小有名气)
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干货分享 | 提取细胞核蛋白的操作步骤
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细胞核提取： 自备试剂与耗材：Triton X-100、蛋白酶抑制剂（Cocktail 等）、DTT、冷冻离心机。 操作步骤： 1） 胰酶消化法收集贴壁生长细胞，或离心法直接收集悬浮培养细胞，离心后弃上清，PBS 洗涤 1 次，细胞量不小于 200万。本人的细胞量是10cm皿长满后（一皿600多万细胞）分两份。 2） 配制Buffer NA 工作液（本人使用的是omiget公司的试剂盒，货号：Omc-06），Buffer NA 中加入 DTT，终浓度为 1 mM，再加入蛋白酶抑制剂（如 Cocktail，终浓度为 1×），充分混匀。多配一份，后面步骤讲继续使用。 3） 配制裂解液：在上一步配制好的 Buffer NA 工作液中加入 Triton X-100，终浓度为 0.2%，混匀， 用于裂解细胞。 4） Buffer NB 工作液配制：Buffer NB 中加入 DTT，终浓度为 1 mM，混匀。多配一份，后面步骤讲继续使用。 5） 细胞沉淀中加入 1 ml 的裂解液，混匀，冰上裂解 20 min，每 5 min 颠倒混匀一次。 6） 取新 EP 管，加入 1 ml Buffer NB 工作液，再将上一步中的细胞裂解液沿 EP 管壁缓慢加于 Buffer NB 工作液上（必须缓慢加入），此时管中液体分两层，轻放于4 ℃离心1,000 rpm，10 min，此时液体依旧分上下两层。 7） 取 0.5 ml 上层液体，转移至新的 1.5 ml EP 管中，即为细胞浆溶液（可保存 在-80 ℃）。 8） 移除EP管中剩余液体，保留沉淀，即为粗细胞核。加入 1 ml Buffer NA 工作液，颠倒混匀，重悬细胞核。 9） 取新 EP 管，在管中加入 1 ml Buffer NB 工作液，将细胞核重悬液沿着 EP 管壁缓慢加到 Buffer NB 工作液上方，液体分两层，1,000 rpm，4 ℃离心 10 min，弃上清，沉淀为细胞核。继续空离，1,000 rpm，4 ℃离心 2 min，用移液枪吸尽残余液体，沉淀即为细胞核，可以裂解，或-80 ℃保存。 10）随后将细胞核与细胞浆用变性裂解液裂解（提取的细胞浆溶液可以 12,000×g，4 ℃离心 15 min，弃沉淀，上清转移至新的离心管，用4× 的细胞裂解液，货号：Omp-03，进行裂解。细胞核本人用2× 的细胞裂解液，货号Omp-01）或者RIPA 裂解液裂解，进行WB验证。 注意事项： 1）细胞量要够，细胞状态良好。 2）以上步骤第6步和第9步很关键，要把控好力度，必须缓慢沿着管壁加入，加入后轻放于离心机，不得震荡、混匀等。 |
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