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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 克隆表达问题
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xiangao

金虫 (正式写手)

[交流] 克隆表达问题

把一段目的基因插入到克隆载体pUC18上，验证已经插上。然后再把这段目的基因切下来，连到表达载体pET系列载体上，问题是目的基因片段与切下来的pUC18差不多大，都2600左右，我怎么把它和pET连接啊？
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1楼 2009-09-05 15:59:44
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司马诸葛

木虫 (正式写手)
我还没开始做实验，帮顶一下吧，顺便学习一下！
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2楼2009-09-05 16:06:20
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xiangao

金虫 (正式写手)
请大家帮助
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3楼2009-09-05 16:33:09
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jack6335

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
xiangao(金币+1,VIP+0): 9-5 17:25
amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流！ 9-5 20:07
一般你合成目的片度时要在其中一段开头加上两个酶切位点，插入克隆载体时用外面一个，插入表达载体时用另一种酶切，这样就行了！
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砖石王老三！！！
4楼2009-09-05 17:09:12
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★
xiangao(金币+1,VIP+0): 9-5 17:30
呵呵，那就加梅切引物位点，设计引物PCR,然后PCR产物酶切，再连pET载体吧，片

段一样大，可真不好区分。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
5楼2009-09-05 17:12:39
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xiangao

金虫 (正式写手)
★ ★
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 9-5 20:08
是这样做的，为了克隆，不过设计酶切位点连到pUC上了，现在想把它再切下来，连到pET上，现在问题就是切的目的片段和pUC差不多大，怎么才能回收克隆的目的片段？
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6楼2009-09-05 17:30:07
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qgaoamtf

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★
xiangao(金币+3,VIP+0): 9-5 18:12
三酶切，其中两个是克隆用的，第三个是切碎pUC载体（目的基因应无此位点）。
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7楼2009-09-05 17:37:20
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★ ★
xiangao(金币+2,VIP+0): 9-5 18:14
引用回帖:
Originally posted by xiangao at 2009-9-5 17:30:
是这样做的，为了克隆，不过设计酶切位点连到pUC上了，现在想把它再切下来，连到pET上，现在问题就是切的目的片段和pUC差不多大，怎么才能回收克隆的目的片段？

不需要回收，直接连接，然后转化大肠杆菌涂板过夜，通过菌落PCR筛选阳性克隆，引物为你扩增此片段的引物，
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8楼2009-09-05 17:38:04
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xiangao

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by gastrodia at 2009-9-5 17:38:

不需要回收，直接连接，然后转化大肠杆菌涂板过夜，通过菌落PCR筛选阳性克隆，引物为你扩增此片段的引物，

我也想过这样做，不过那样做工作量肯定很大，太多的假阳性
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9楼2009-09-05 18:15:24
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xiangao

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by qgaoamtf at 2009-9-5 17:37:
三酶切，其中两个是克隆用的，第三个是切碎pUC载体（目的基因应无此位点）。

和我师兄建议的一样，不过目的基因上没有的，恰好在puc片段上的酶切位点，很稀少  而且是不常见的，我们实验室没有那种酶
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10楼2009-09-05 18:17:40
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