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xiangao

金虫 (正式写手)

[交流] 克隆表达问题

把一段目的基因插入到克隆载体pUC18上,验证已经插上。然后再把这段目的基因切下来,连到表达载体pET系列载体上,问题是目的基因片段与切下来的pUC18差不多大,都2600左右,我怎么把它和pET连接啊?
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司马诸葛

木虫 (正式写手)

我还没开始做实验,帮顶一下吧,顺便学习一下!
2楼2009-09-05 16:06:20
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xiangao

金虫 (正式写手)

请大家帮助
3楼2009-09-05 16:33:09
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jack6335

铁杆木虫 (正式写手)

★ ★
xiangao(金币+1,VIP+0): 9-5 17:25
amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流! 9-5 20:07
一般你合成目的片度时要在其中一段开头加上两个酶切位点,插入克隆载体时用外面一个,插入表达载体时用另一种酶切,这样就行了!
砖石王老三!!!
4楼2009-09-05 17:09:12
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献


xiangao(金币+1,VIP+0): 9-5 17:30
呵呵,那就加梅切引物位点,设计引物PCR,然后PCR产物酶切,再连pET载体吧,片

段一样大,可真不好区分。
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
5楼2009-09-05 17:12:39
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xiangao

金虫 (正式写手)

★ ★
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流! 9-5 20:08
是这样做的,为了克隆,不过设计酶切位点连到pUC上了,现在想把它再切下来,连到pET上,现在问题就是切的目的片段和pUC差不多大,怎么才能回收克隆的目的片段?
6楼2009-09-05 17:30:07
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qgaoamtf

至尊木虫 (职业作家)

★ ★ ★
xiangao(金币+3,VIP+0): 9-5 18:12
三酶切,其中两个是克隆用的,第三个是切碎pUC载体(目的基因应无此位点)。
7楼2009-09-05 17:37:20
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gastrodia

金虫 (正式写手)

★ ★
xiangao(金币+2,VIP+0): 9-5 18:14
引用回帖:
Originally posted by xiangao at 2009-9-5 17:30:
是这样做的,为了克隆,不过设计酶切位点连到pUC上了,现在想把它再切下来,连到pET上,现在问题就是切的目的片段和pUC差不多大,怎么才能回收克隆的目的片段?

不需要回收,直接连接,然后转化大肠杆菌涂板过夜,通过菌落PCR筛选阳性克隆,引物为你扩增此片段的引物,
8楼2009-09-05 17:38:04
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xiangao

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by gastrodia at 2009-9-5 17:38:

不需要回收,直接连接,然后转化大肠杆菌涂板过夜,通过菌落PCR筛选阳性克隆,引物为你扩增此片段的引物,

我也想过这样做,不过那样做工作量肯定很大,太多的假阳性
9楼2009-09-05 18:15:24
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xiangao

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by qgaoamtf at 2009-9-5 17:37:
三酶切,其中两个是克隆用的,第三个是切碎pUC载体(目的基因应无此位点)。

和我师兄建议的一样,不过目的基因上没有的,恰好在puc片段上的酶切位点,很稀少  而且是不常见的,我们实验室没有那种酶
10楼2009-09-05 18:17:40
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