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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 克隆表达问题
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xuezhen

银虫 (小有名气)
学习一下！
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11楼2009-09-05 18:27:08
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★
xiangao(金币+2,VIP+0): 9-5 20:17
我同意楼上的观点，不需要回收，直接连接，然后转化大肠杆菌涂板过夜，通过菌落PCR筛选阳性克隆，引物为你扩增此片段的引物， 这种方法很简便，比重新设计引物加酶切位点方便的多

[ Last edited by huangdi07 on 2009-9-5 at 19:49 ]
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12楼2009-09-05 19:48:26
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★ ★
amisking(金币+1,VIP+0): 9-5 20:08
xiangao(金币+1,VIP+0): 9-5 20:22
工作量大？你要是我的学生，我肯定要给你当头棒——————喝一下，目的条带和剩余片段大小差不多，因此和表达载体的连接几率各占50%，你转化后菌落PCR的工作量还会大？
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13楼2009-09-05 20:06:08
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changes

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 9-5 23:04
引用回帖:
Originally posted by gastrodia at 2009-9-5 20:06:
工作量大？你要是我的学生，我肯定要给你当头棒——————喝一下，目的条带和剩余片段大小差不多，因此和表达载体的连接几率各占50%，你转化后菌落PCR的工作量还会大？

呵呵，确实没有更好的策略了。三酶切做不了。
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14楼2009-09-05 20:35:25
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greatwall8596

没有那种酶就买啊，这是最好的方法了
买个酶很简单的
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15楼2009-09-05 21:16:56
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anik

银虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 9-5 23:03
如果你的引物酶切位点前的保护碱基数量能够达到三个或三个以上的话，可以回收PCR产物然后用你的酶进行酶切，然后再连接。
另外，你可以换一种载体。总不能在一个树上吊死，实验的思路和方法很多的。。。
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16楼2009-09-05 21:58:19
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kitty8682

金虫 (正式写手)
还是设计引物加酶切位点，重新PCR，酶切，回收转化吧
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17楼2009-09-06 08:36:59
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shensc727

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这个问题有意思！
期待更多高手回答！
帮顶！！！
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18楼2009-09-06 08:43:55
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w.king124

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
以上方法都可以，关键是得做的用心
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19楼2009-09-06 10:52:34
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wuqiang001

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
同意楼上的话，建议用gastrodia 所说的！
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20楼2009-09-06 15:48:15
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