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南方科技大学公共卫生及应急管理学院2025级博士研究生招生报考通知
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zsm0507

金虫 (小有名气)

[交流] 诡异PCR扩增,扩出来一次,就再也扩不出来了

诡异PCR扩增,就第一次扩出来了,以后再也扩不出来了,或者条件和扩出来那次没有任何改变,真的快郁闷死了。希望PCR高手指点下,万分感谢!

[ Last edited by 350784478 on 2009-9-6 at 08:34 ]
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paulajjh

木虫 (著名写手)

你用的什么模板啊?
2楼2009-09-05 10:57:15
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paulajjh

木虫 (著名写手)

我之前做过细菌基因的PCR,如果用菌液,很不稳定,经常重复性很差.但后来提取基因组,再P就很稳定了
3楼2009-09-05 10:58:16
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112976553

金虫 (小有名气)

多P几次,总会成功~

我许下第一千零一个愿望
4楼2009-09-05 11:02:41
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huanginae5500

新虫 (初入文坛)

★ ★ ★ ★
amisking(金币+3,VIP+0):欢迎发帖交流! 9-5 14:56
zsm0507(金币+1,VIP+0): 9-13 08:30
看看是不是引物的效力不高。引物效力不高的话(简并碱基较多),有时候可以扩增出来,但是大多时候可能扩不出来。并且有的基因在不同支系中的进化规律有所不同,因此不同的支系可能需要设计不同的引物。如果简并碱基多的话,适当减少。
5楼2009-09-05 11:15:49
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houjinglhy

荣誉版主 (文坛精英)

表达自由,人权之基。

优秀版主

★ ★ ★
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流! 9-5 14:56
zsm0507(金币+1,VIP+0): 9-13 08:30
这个原因太多了 你一个一个排查吧
首先确定质粒和酶没问题!
模板和酶用的越少越好,退火温度能高则高!
换条件试试吧
从小就学习鲁迅,直到现在才体会到他当时是多么的绝望和无助,却仍要用尽最后一丝力气声嘶力竭的呐喊!
6楼2009-09-05 13:38:30
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

第一次扩出来是不是非特异扩增还是污染了什么东西
7楼2009-09-05 13:48:26
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jack6335

铁杆木虫 (正式写手)

估计是你引物出问题了,重新合成引物试试!
砖石王老三!!!
8楼2009-09-05 13:53:24
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zsm0507

金虫 (小有名气)

谢谢大家,我用的模板是基因组,第一次扩出来的时候是二千多,以后再也没扩出来过,即使扩出来也是只有1500,应该不是,那为什么能扩出来呢,而且第一次我扩了两个重复都扩出来了
9楼2009-09-05 14:11:25
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huanginae5500

新虫 (初入文坛)


zsm0507(金币+1,VIP+0): 9-13 08:30
引用回帖:
Originally posted by huanginae5500 at 2009-9-5 11:15:
看看是不是引物的效力不高。引物效力不高的话(简并碱基较多),有时候可以扩增出来,但是大多时候可能扩不出来。并且有的基因在不同支系中的进化规律有所不同,因此不同的支系可能需要设计不同的引物。如果简并碱 ...

如果你第一次p出来的是目的片段,并且后面的实验条件都没变的话,我还是觉得可能是引物的问题。我们最近在做的一组实验也是一开始用的引物不好,后来适当改进引物,减少了简并碱基;并针对不同的类群设计了几组引物。
10楼2009-09-06 00:20:15
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