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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 诡异PCR扩增，扩出来一次，就再也扩不出来了
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zsm0507

金虫 (小有名气)

[交流] 诡异PCR扩增，扩出来一次，就再也扩不出来了

诡异PCR扩增，就第一次扩出来了，以后再也扩不出来了，或者条件和扩出来那次没有任何改变，真的快郁闷死了。希望PCR高手指点下，万分感谢！

[ Last edited by 350784478 on 2009-9-6 at 08:34 ]
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1楼 2009-09-05 09:41:44
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paulajjh

木虫 (著名写手)
你用的什么模板啊?
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2楼2009-09-05 10:57:15
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paulajjh

木虫 (著名写手)
我之前做过细菌基因的PCR,如果用菌液,很不稳定,经常重复性很差.但后来提取基因组,再P就很稳定了
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3楼2009-09-05 10:58:16
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112976553

金虫 (小有名气)
多P几次，总会成功~

我许下第一千零一个愿望
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4楼2009-09-05 11:02:41
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huanginae5500

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
amisking(金币+3,VIP+0):欢迎发帖交流！ 9-5 14:56
zsm0507(金币+1,VIP+0): 9-13 08:30
看看是不是引物的效力不高。引物效力不高的话（简并碱基较多），有时候可以扩增出来，但是大多时候可能扩不出来。并且有的基因在不同支系中的进化规律有所不同，因此不同的支系可能需要设计不同的引物。如果简并碱基多的话，适当减少。
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5楼2009-09-05 11:15:49
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houjinglhy

荣誉版主 (文坛精英)

表达自由，人权之基。

优秀版主
★ ★ ★
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 9-5 14:56
zsm0507(金币+1,VIP+0): 9-13 08:30
这个原因太多了 你一个一个排查吧
首先确定质粒和酶没问题！
模板和酶用的越少越好，退火温度能高则高！
换条件试试吧
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从小就学习鲁迅，直到现在才体会到他当时是多么的绝望和无助，却仍要用尽最后一丝力气声嘶力竭的呐喊！
6楼2009-09-05 13:38:30
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
第一次扩出来是不是非特异扩增还是污染了什么东西
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7楼2009-09-05 13:48:26
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jack6335

铁杆木虫 (正式写手)
估计是你引物出问题了，重新合成引物试试！
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砖石王老三！！！
8楼2009-09-05 13:53:24
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zsm0507

金虫 (小有名气)
谢谢大家，我用的模板是基因组，第一次扩出来的时候是二千多，以后再也没扩出来过，即使扩出来也是只有1500，应该不是，那为什么能扩出来呢，而且第一次我扩了两个重复都扩出来了
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9楼2009-09-05 14:11:25
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huanginae5500

新虫 (初入文坛)
★
zsm0507(金币+1,VIP+0): 9-13 08:30
引用回帖:
Originally posted by huanginae5500 at 2009-9-5 11:15:
看看是不是引物的效力不高。引物效力不高的话（简并碱基较多），有时候可以扩增出来，但是大多时候可能扩不出来。并且有的基因在不同支系中的进化规律有所不同，因此不同的支系可能需要设计不同的引物。如果简并碱 ...

如果你第一次p出来的是目的片段，并且后面的实验条件都没变的话，我还是觉得可能是引物的问题。我们最近在做的一组实验也是一开始用的引物不好，后来适当改进引物，减少了简并碱基；并针对不同的类群设计了几组引物。
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10楼2009-09-06 00:20:15
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