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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 质粒载体双酶切无条带是何原因
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greatsaint

银虫 (小有名气)

[交流] 质粒载体双酶切无条带是何原因

目前已将目的片段连接到了质粒载体上，用原引物检测得到了目的条带。现在双酶切质粒却没有条带是什么原因呢？反应体系是20μl，质粒DNA1μl，反应5h。电泳后什么也看不到。是上样量的问题吗？
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1楼 2009-08-24 20:19:58
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xiaoyadxy

金虫 (小有名气)
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amisking(金币+2,VIP+0): 10-7 16:53
质粒DNA1μl的量太少了，你的双酶切的效率是多高啊，这么少的模板量在20μl体系里再去其中的一点电泳可能什么都看不见
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4楼2009-08-24 20:46:30
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
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amisking(金币+2,VIP+0): 10-7 16:33
有原来的质粒片段吗？是所有的条带都没有，还是只有目的条带没有呢？也有可能是你提的质粒质量不是太好，酶切时候降解啦！你可以先加大质粒的量再酶切一下，如果还是没有的话，我建议你纯化一下质粒，然后再酶切！
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
10楼2009-08-25 08:26:55
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普通回帖

beisimai895

木虫 (小有名气)
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amisking(金币+2,VIP+0): 10-7 16:53
你可以将质粒的量再多加一些,会不会是质粒的量太少,电泳检测不出,又或者是又酶切,那你的buffer 用对了吗?
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2楼2009-08-24 20:24:29
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
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可能性非常大，越短的片段越看不清楚
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3楼2009-08-24 20:24:37
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baiyidao

金虫 (小有名气)
★
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酶切BUFFER最重要，酶的储藏条件,
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5楼2009-08-24 20:49:46
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ytetyio09

新虫 (正式写手)
1μl is not enough
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6楼2009-08-24 22:35:53
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傻子

木虫 (正式写手)
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amisking(金币+2,VIP+0): 10-7 16:33
可以试试PAGE电泳，我做过1微升酶切后PAGE跑的条带很清晰。但是双酶切的体系要注意，buffer要合适，能对两种酶适用，不知道你用的那种酶，我用的NEB的，他们有具体的双酶切的说明，你可以看看，或者找你所用酶的说明看看有没有对双酶切体系buffer的建议。
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1984年中国制造,长173CM,净重64kg,采用人工智能，国家免检优质产品。
7楼2009-08-24 23:54:33
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greatsaint

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by beisimai895 at 2009/8/24 20:24:
你可以将质粒的量再多加一些,会不会是质粒的量太少,电泳检测不出,又或者是又酶切,那你的buffer 用对了吗?

我用的也是NEB的，我从网站查的，两种酶切用的buffer3。
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8楼2009-08-25 08:20:47
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greatsaint

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 傻子 at 2009/8/24 23:54:
可以试试PAGE电泳，我做过1微升酶切后PAGE跑的条带很清晰。但是双酶切的体系要注意，buffer要合适，能对两种酶适用，不知道你用的那种酶，我用的NEB的，他们有具体的双酶切的说明，你可以看看，或者找你所用酶的说 ...

我用的也是NEB的，共用buffer也是从其网站查的。我没做过PAGE，怎么做？麻烦吗？都用那些设备？
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9楼2009-08-25 08:22:40
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