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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 质粒载体双酶切无条带是何原因
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paulajjh

木虫 (著名写手)
★
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我不知道你之前的质粒浓度？如果很浓，现在没有条带，那有可能是酶切的问题。但如果之前就不浓，那你加大上样量看看
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11楼2009-08-25 08:32:28
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heismeng

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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amisking(金币+3,VIP+0): 10-7 16:53
一般酶切都是10U对应1微克
然后注意甲基化
还有跑电泳的时候是否有超螺旋结构，有就说明没切动
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12楼2009-08-25 08:38:36
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yuanfeng

金虫 (小有名气)
★
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我们20ul体系一般用10ul质粒
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13楼2009-08-25 09:00:56
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zhyzx

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0): 10-7 16:34
如果只是检测一下是否有目的条带的话，10ul体系就够了，我们的做法是8ul质粒，1ulBuffer,1ul酶。这样效果很好。
你的问题可以看看琼脂糖胶是不是比较厚同时片段又比较小，这样的话很难看出来。
祝顺利！
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14楼2009-08-25 11:07:37
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kitty8682

金虫 (正式写手)
★
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反应体系可以适当加大一些，而且酶切五小时会不会是时间过长，我平时就用两三小时
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15楼2009-08-25 13:22:51
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tangtl

木虫 (正式写手)

小木虫潜水者
★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0): 10-8 15:06
关键是你双酶切的目的片段大小，如果100bp内的。一般都看不到，我曾经用了高浓度的胶想跑小条带出来。结果是没有看到！一般你把没有酶切的对照一起跑电泳、可以看到明显的滞后性，然后通过转化来验证双酶切是否成功。
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16楼2009-08-25 15:17:10
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greatsaint

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by tangtl at 2009/8/25 15:17:
关键是你双酶切的目的片段大小，如果100bp内的。一般都看不到，我曾经用了高浓度的胶想跑小条带出来。结果是没有看到！一般你把没有酶切的对照一起跑电泳、可以看到明显的滞后性，然后通过转化来验证双酶切是否成 ...

我的目的片段在750bp左右，我想应该能看到的。
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17楼2009-08-25 17:21:52
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beike2208

木虫 (初入文坛)
★
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查一下这两个酶在该buffer中的效率，如果效率太低就换一下。要是酶失活的话也可能。
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18楼2009-08-25 19:40:33
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
原因很多~好好反思一下自己的实验步骤~然后找准错误或者很有可能错误的地方，重新来一遍~
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
19楼2009-08-25 19:45:30
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caicaiyy

铜虫 (小有名气)
★
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质粒能跑出来吗？如果质粒能跑出来那就是酶切的问题，如果不能跑出来那就是电泳的问题、
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20楼2009-10-07 16:05:20
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