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paulajjh

木虫 (著名写手)


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我不知道你之前的质粒浓度?如果很浓,现在没有条带,那有可能是酶切的问题。但如果之前就不浓,那你加大上样量看看
11楼2009-08-25 08:32:28
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heismeng

金虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★
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amisking(金币+3,VIP+0): 10-7 16:53
一般酶切都是10U对应1微克
然后注意甲基化
还有跑电泳的时候是否有超螺旋结构,有就说明没切动
12楼2009-08-25 08:38:36
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yuanfeng

金虫 (小有名气)


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我们20ul体系一般用10ul质粒
13楼2009-08-25 09:00:56
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zhyzx

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0): 10-7 16:34
如果只是检测一下是否有目的条带的话,10ul体系就够了,我们的做法是8ul质粒,1ulBuffer,1ul酶。这样效果很好。
你的问题可以看看琼脂糖胶是不是比较厚同时片段又比较小,这样的话很难看出来。
祝顺利!
14楼2009-08-25 11:07:37
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kitty8682

金虫 (正式写手)


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反应体系可以适当加大一些,而且酶切五小时会不会是时间过长,我平时就用两三小时
15楼2009-08-25 13:22:51
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tangtl

木虫 (正式写手)

小木虫潜水者

★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0): 10-8 15:06
关键是你双酶切的目的片段大小,如果100bp内的。一般都看不到,我曾经用了高浓度的胶想跑小条带出来。结果是没有看到!一般你把没有酶切的对照一起跑电泳、可以看到明显的滞后性,然后通过转化来验证双酶切是否成功。
16楼2009-08-25 15:17:10
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greatsaint

银虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by tangtl at 2009/8/25 15:17:
关键是你双酶切的目的片段大小,如果100bp内的。一般都看不到,我曾经用了高浓度的胶想跑小条带出来。结果是没有看到!一般你把没有酶切的对照一起跑电泳、可以看到明显的滞后性,然后通过转化来验证双酶切是否成 ...

我的目的片段在750bp左右,我想应该能看到的。
17楼2009-08-25 17:21:52
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beike2208

木虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
查一下这两个酶在该buffer中的效率,如果效率太低就换一下。要是酶失活的话也可能。
18楼2009-08-25 19:40:33
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

原因很多~好好反思一下自己的实验步骤~然后找准错误或者很有可能错误的地方,重新来一遍~
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
19楼2009-08-25 19:45:30
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caicaiyy

铜虫 (小有名气)


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质粒能跑出来吗?如果质粒能跑出来那就是酶切的问题,如果不能跑出来那就是电泳的问题、
20楼2009-10-07 16:05:20
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