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selex筛选核酸适配体，pcr扩增后产率极低
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 各位大佬求指导 ! ! !期待大家广泛讨论 问题：我采用磁珠法筛选适配体，但是得到的目的产物量极少，无法开展后续实验。二次扩增会放大扩增偏好，所以还是想只扩增一次，提高PCR产率。 大致筛选情况如下：我采用羧基磁珠偶联目标蛋白，然后与76 nt的DNA文库（5’-TTCAGCACTCCAGGCATAGC-N(36)-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’ ）孵育，洗脱未结合的文库，加入200 uL pH 7.4的hepes溶液（20 mM HEPES, 0.05 M NaCl, 2 mM CaCl2, pH 7.4）煮沸磁珠，使文库变性脱落到溶液中，将溶液用于PCR扩增，pcr扩增程序设置为：step 1，95 ℃, 3 minstep 2，95 ℃, 30 s；60 ℃, 30 s；72 ℃, 30 sstep 3，Go to step 2 for 34 cyclesstep 4，72 ℃， 5 minstep 5，4 ℃，forever（pcr之前做过QPCR，计算出扩增效率正常）另外，大概是因为扩增次数过多，产生的非特异性条带也很多。 完后，正丁醇浓缩PCR产物体积至100 uL左右，采用10% denaturing PAGE gel分离目的条带，切胶，elution buffer提取，正丁醇浓缩，乙醇沉淀，真空旋干，最终得到约2 ug的产物（文库），难以进行后续实验。 个人设想会不会是筛选缓冲液影响（试过投入相同量的DNA模板，buffer用水，但也没有提高多少产率），模板投入量提高后产率略有提高，或者煮沸液中含有pcr抑制剂（QPCR的Ct值在11轮左右，感觉可以排除这个原因）后续打算用原始文库扩增试一下，看产率是否提高，再次排除抑制剂的影响。或者每一轮的pcr都需要进行条件优化吗，关于退火时间，温度，循环数。扩增循环数增加，非特异性条带增多会导致目的产物变少吗？刚接触到适配体筛选以及PCR这些技术，还挺懵的，请大家指导一下。 真心期待大家一起讨论，感谢大佬相助 |
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2楼2021-10-12 15:59:29
yubeihong
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