| 查看: 1886 | 回复: 5 | ||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者Tiancccccc将赠送您 5 个金币 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
selex筛选核酸适配体，pcr扩增后产率极低
|
||
 各位大佬求指导 ! ! !期待大家广泛讨论 问题：我采用磁珠法筛选适配体，但是得到的目的产物量极少，无法开展后续实验。二次扩增会放大扩增偏好，所以还是想只扩增一次，提高PCR产率。 大致筛选情况如下：我采用羧基磁珠偶联目标蛋白，然后与76 nt的DNA文库（5’-TTCAGCACTCCAGGCATAGC-N(36)-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’ ）孵育，洗脱未结合的文库，加入200 uL pH 7.4的hepes溶液（20 mM HEPES, 0.05 M NaCl, 2 mM CaCl2, pH 7.4）煮沸磁珠，使文库变性脱落到溶液中，将溶液用于PCR扩增，pcr扩增程序设置为：step 1，95 ℃, 3 minstep 2，95 ℃, 30 s；60 ℃, 30 s；72 ℃, 30 sstep 3，Go to step 2 for 34 cyclesstep 4，72 ℃， 5 minstep 5，4 ℃，forever（pcr之前做过QPCR，计算出扩增效率正常）另外，大概是因为扩增次数过多，产生的非特异性条带也很多。 完后，正丁醇浓缩PCR产物体积至100 uL左右，采用10% denaturing PAGE gel分离目的条带，切胶，elution buffer提取，正丁醇浓缩，乙醇沉淀，真空旋干，最终得到约2 ug的产物（文库），难以进行后续实验。 个人设想会不会是筛选缓冲液影响（试过投入相同量的DNA模板，buffer用水，但也没有提高多少产率），模板投入量提高后产率略有提高，或者煮沸液中含有pcr抑制剂（QPCR的Ct值在11轮左右，感觉可以排除这个原因）后续打算用原始文库扩增试一下，看产率是否提高，再次排除抑制剂的影响。或者每一轮的pcr都需要进行条件优化吗，关于退火时间，温度，循环数。扩增循环数增加，非特异性条带增多会导致目的产物变少吗？刚接触到适配体筛选以及PCR这些技术，还挺懵的，请大家指导一下。 真心期待大家一起讨论，感谢大佬相助 |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有120人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
4楼2021-10-19 13:29:52
2楼2021-10-12 15:59:29
yubeihong
铁杆木虫 (职业作家)
- 应助: 20 (小学生)
- 金币: 7537.3
- 散金: 605
- 红花: 40
- 帖子: 3051
- 在线: 641小时
- 虫号: 253258
- 注册: 2006-05-20
- 性别: GG
- 专业: 生物化工与食品化工
3楼2021-10-15 22:49:46
5楼2022-04-26 10:17:10
20