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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于考马斯亮兰法测定蛋白质
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lanlan1119

金虫 (小有名气)

[交流] 关于考马斯亮兰法测定蛋白质

我用考马斯亮兰法测蛋白含量时，做标准曲线用的G-球蛋白溶液（1mg/ml）是用纯化水溶解的，得到的标准曲线相关性是0.99947。
但做样品时，样品在纯化水中很难溶解，我用0.5%的碳酸氢钠溶解配制成1mg/ml（空白加入0.1ml的0.5%的碳酸氢钠和5ml的考马斯亮兰，且0.5%的碳酸氢钠在595nm下测紫外吸收为0.001），取0.04ml的样品溶液再用纯化水补充至0.1ml后测定，一共测定了六批样品，得到的蛋白含量都在0.5%左右，而用hplc测得的六批样品纯度都在95%以上，蛋白含量测定值明显偏高。
问题是不是出在标准曲线上啊，因为标准曲线是用纯化水溶解的，而样品测定时是用0.5%的碳酸氢钠溶解的。
请有经验的高手指点
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1楼2009-08-20 17:36:00
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austin2008

铁杆木虫 (著名写手)
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amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-20 22:14
是啊，标准曲线测定条件要与实验测定条件一致，紫外吸收为0.001这个值太小很不准确，蛋白浓度太低了！吸光度值在0.2-0.8之间是比较准确的
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优秀是一种习惯;生命是一种过程;放弃是一种智慧;缺点是一种恩惠!
2楼2009-08-20 19:19:07
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wangyh2028

铁虫 (小有名气)
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用的是测核酸的小比色杯吧？我们一般不用那个，都用那个大的。 标准曲线要和测定的实际溶液一致才比较准确。
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3楼2009-08-20 22:14:17
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飘在海上的雪

木虫 (正式写手)
★
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首先如2楼所说，检测样品条件与标准曲线一定一致；再有是否确保样品的吸光值在你的标准曲线范围内呢，这非常重要。
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不在沉默中爆发，就在沉默着死亡！
4楼2009-08-21 08:37:43
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lanlan1119

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 飘在海上的雪 at 2009-8-21 08:37:
首先如2楼所说，检测样品条件与标准曲线一定一致；再有是否确保样品的吸光值在你的标准曲线范围内呢，这非常重要。

我用0.5%的碳酸氢钠配制的标准溶液，测出来的标准曲线的相关性也可以0.9997.但是根据标准曲线计算出的样品中的蛋白含量还是挺高。
不大明白楼上所说的“是否确保样品的吸光值在你的标准曲线范围内呢”是什么意思。我做的样品吸收值都在0.018~0.047之间，标准曲线的吸收都在0.059~0.562之间，如楼上所说，我应该曾加样品测定时样品溶液的加入量，或者重新绘制更低浓度范围内的标准曲线，使样品的吸收值在标准曲线的吸收范围内吗？

可不可以采用这样一种方法：在配制样品溶液时，每个样品管中加入40微升的样品溶液和20微升的g-球蛋白，最后再加入0.5%的碳酸氢钠40微升至，这样整个样品测定时的吸光值就上去了，也会在标准曲线的吸收范围内，计算的时候再扣除加入的g-球蛋白的量。

[ Last edited by lanlan1119 on 2009-8-21 at 09:44 ]
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5楼2009-08-21 09:24:35
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lanlan1119

金虫 (小有名气)
影响考马斯亮兰法测定蛋白含量的干扰因素都有哪些，哪位大侠能指点一二
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6楼2009-08-21 10:27:33
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HarveyWang

捐助贵宾 (知名作家)

海外行者
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amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-21 17:49
pH 和反应温度 影响 考法测定太厉害了！

就是连重复性都做不好的。。。不信，LZ 改个时间再做下标准曲线，会跟原来的又不一样的。

我试过，很不准！
某人所说的每次都做标准曲线标定， 这这。。。还叫标准曲线吗？！

建议LZ 改用 Lowry法， 以BSA或 人血白蛋白 做标品！

[ Last edited by HarveyWang on 2009-8-21 at 10:44 ]
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【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
7楼2009-08-21 10:42:41
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smallcat227

木虫 (著名写手)
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amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-21 17:49
引用回帖:
Originally posted by lanlan1119 at 2009-8-21 09:24:

我用0.5%的碳酸氢钠配制的标准溶液，测出来的标准曲线的相关性也可以0.9997.但是根据标准曲线计算出的样品中的蛋白含量还是挺高。
不大明白楼上所说的“是否确保样品的吸光值在你的标准曲线范围内呢”是什么意 ...

范围是对的，但是分光光度计在吸光值0.1甚至0.2以下得出的值都不是非常准确的

关于加球蛋白的问题，如果样品浓度相对本底太低，效果还是不太好，还是建议加量比色

另外，考法测蛋白确实太灵敏了，影响因素比较多，不过相对比较容易，祝楼主好运！
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8楼2009-08-21 17:45:21
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zhuangqli

金虫 (小有名气)
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引用回帖:
Originally posted by lanlan1119 at 2009-8-21 09:24:

我用0.5%的碳酸氢钠配制的标准溶液，测出来的标准曲线的相关性也可以0.9997.但是根据标准曲线计算出的样品中的蛋白含量还是挺高。
不大明白楼上所说的“是否确保样品的吸光值在你的标准曲线范围内呢”是什么意 ...

你的样品吸光值相对标准曲线偏小，值也偏小，建议加大样品浓度测
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9楼2009-08-21 18:04:51
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zhuangyong

新虫 (初入文坛)
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做测定标准曲线时，应该检验是否都是在没有蛋白质的参比溶液下所测得到的吸光度值
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10楼2009-08-21 19:54:21
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