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沙墨石

新虫 (初入文坛)

[交流] 镍柱亲和层析,纯化结果总是有三四十kDa的杂蛋白 已有4人参与

请教一下,用大肠杆菌表达目的蛋白,超声破碎后,使用镍柱亲和层析时,填料是Ni-IMAC,结合缓冲液是20mmol/L的Tris-HCl,500mmol/L  NaCl,pH7.5。
SDS-PAGE蛋白胶图上,总是有三四十kDa的杂蛋白,应该怎样提高纯化效果呢?
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forhighbio

捐助贵宾 (著名写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
吧这个蛋白打个质谱,分析下是什么蛋白。

发自小木虫Android客户端
2楼2021-09-04 21:31:16
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SA13008082

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
等度洗脱还是线性洗脱?

发自小木虫Android客户端
3楼2021-09-05 22:22:11
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pennchem

专家顾问 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
如果不表达质粒,平行做实验,能看到这条带吗?
1:如果是目的蛋白分子量大于该条带,则可能是目的条带降解产物,
2:如果是该蛋白比目的蛋白大,可能是目的蛋白聚合物
3:可能是大肠杆菌自身的蛋白(有些文献会报道)

1,2比较难除去,分子量差别大考虑分子筛
3的话,过离子交换柱或其他柱子可能有效
行至水穷处,坐看云起时
4楼2021-09-06 18:11:45
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小汰宝

金虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
可能性之一是质粒带的抗性蛋白。表达量高,如果刚好有几个his,也容易挂在镍柱上。梯度洗脱可以提高纯度

发自小木虫IOS客户端
5楼2021-11-25 12:10:00
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