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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 镍柱亲和层析，纯化结果总是有三四十kDa的杂蛋白
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沙墨石

新虫 (初入文坛)

[交流] 镍柱亲和层析，纯化结果总是有三四十kDa的杂蛋白 已有4人参与

请教一下，用大肠杆菌表达目的蛋白，超声破碎后，使用镍柱亲和层析时，填料是Ni-IMAC，结合缓冲液是20mmol/L的Tris-HCl，500mmol/L  NaCl，pH7.5。
SDS-PAGE蛋白胶图上，总是有三四十kDa的杂蛋白，应该怎样提高纯化效果呢？
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1楼 2021-09-04 16:03:24
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forhighbio

捐助贵宾 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
吧这个蛋白打个质谱，分析下是什么蛋白。

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2楼2021-09-04 21:31:16
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SA13008082

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
等度洗脱还是线性洗脱？

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3楼2021-09-05 22:22:11
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pennchem

专家顾问 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
如果不表达质粒，平行做实验，能看到这条带吗？
1：如果是目的蛋白分子量大于该条带，则可能是目的条带降解产物，
2：如果是该蛋白比目的蛋白大，可能是目的蛋白聚合物
3：可能是大肠杆菌自身的蛋白（有些文献会报道）

1,2比较难除去，分子量差别大考虑分子筛
3的话，过离子交换柱或其他柱子可能有效
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行至水穷处，坐看云起时
4楼2021-09-06 18:11:45
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小汰宝

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可能性之一是质粒带的抗性蛋白。表达量高，如果刚好有几个his，也容易挂在镍柱上。梯度洗脱可以提高纯度

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5楼2021-11-25 12:10:00
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