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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 被DEAE FF折磨吐了
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gxmpcc

新虫 (初入文坛)

[求助] 被DEAE FF折磨吐了 已有1人参与

请教各位前辈，我目前要纯化一种蛋白，无标签，约60KD，PI5.1

实验步骤如下：

样品处理：

1.组织溶于等体积标准盐溶液（含100mM Kcl）样品洗涤超声离心弃上清取沉淀，重复3次

2.沉淀复悬于5倍体积提取液（含500mmNacl）超声离心弃上清取沉淀，重复2次

3.沉淀复悬于Buffer A（10mM 磷酸二氢钠），超声后过滤膜得上柱样品

柱子为DEAE FF 1ml

平衡和洗脱缓Buffer均为磷酸二氢钠（含8M尿素），分别为10mM和1000mM,PH均为7.0

上柱前曾用BufferA(10mM)平衡20个柱体积至基线平稳，上样量为10ml

洗脱方式为梯度浓度洗脱，以2ml/min，10ml一管收集；梯度浓度设置如下

NO      时间       A%        B%
1           0         100         0
2          30         90         10
3          90         85         15
4         150        80         20  
5         240        60         40
6         300        50         50
7         360        30         70
8         390         0         100

因实验室没有电导仪，所以没有测过电导

出现的问题：
按梯度浓度收集80管样品，总是在第一管出现目的蛋白和一些杂蛋白，后续管里无任何蛋白。尝试过改变PH为6.5，7.5，8.0，结果依然如此。请教各位前辈这是没挂上柱子吗？在不换柱子得情况下有哪些可以改进的地方？
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@冼亮淀粉酶

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1楼 2021-07-15 20:18:46
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1234568a

新虫 (初入文坛)
你好，我想请问一下你的填料是怎么处理再生的

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5楼2023-03-05 09:25:13
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
既然你溶解样品没用尿素，你的纯化缓冲为啥要用尿素？变性后的等电点和理论等电点是不一样的。

发自小木虫Android客户端
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
2楼2021-07-16 09:19:24
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gxmpcc

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by snoopyzxx at 2021-07-16 09:19:24
既然你溶解样品没用尿素，你的纯化缓冲为啥要用尿素？变性后的等电点和理论等电点是不一样的。

我样品是重悬于Buffer A然后上样的，里面含尿素。只是前面粗提取的过程中没有加尿素
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3楼2021-07-16 15:03:26
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walking dead

金虫 (小有名气)

填料制备和蛋白纯化专家

【答案】应助回帖

用的哪家的DEAE-FF，你纯化的目的蛋白是什么，纯度需要多少，收率多少。这些我们都可以给解决，可以做工艺开发，18706882210
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4楼2021-08-03 10:34:35
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