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被DEAE FF折磨吐了 已有1人参与
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请教各位前辈，我目前要纯化一种蛋白，无标签，约60KD，PI5.1 实验步骤如下： 样品处理： 1.组织溶于等体积标准盐溶液（含100mM Kcl）样品洗涤超声离心弃上清取沉淀，重复3次 2.沉淀复悬于5倍体积提取液（含500mmNacl）超声离心弃上清取沉淀，重复2次 3.沉淀复悬于Buffer A（10mM 磷酸二氢钠），超声后过滤膜得上柱样品 柱子为DEAE FF 1ml 平衡和洗脱缓Buffer均为磷酸二氢钠（含8M尿素），分别为10mM和1000mM,PH均为7.0 上柱前曾用BufferA(10mM)平衡20个柱体积至基线平稳，上样量为10ml 洗脱方式为梯度浓度洗脱，以2ml/min，10ml一管收集；梯度浓度设置如下 NO 时间 A% B% 1 0 100 0 2 30 90 10 3 90 85 15 4 150 80 20 5 240 60 40 6 300 50 50 7 360 30 70 8 390 0 100 因实验室没有电导仪，所以没有测过电导 出现的问题： 按梯度浓度收集80管样品，总是在第一管出现目的蛋白和一些杂蛋白，后续管里无任何蛋白。尝试过改变PH为6.5，7.5，8.0，结果依然如此。请教各位前辈这是没挂上柱子吗？在不换柱子得情况下有哪些可以改进的地方？ |
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