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载体测序无信号是怎么回事？ 已有1人参与
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我之前用Infusion的方法连接不上，总是连上了两端，中间缺失。然后我就换用T4连接的方法，先连接在T载体上，然后进行菌液PCR，条带正确，提了质粒，双酶切，胶回收后用于T4连接到我的骨架载体上，再进行菌液PCR，条带正确，送菌液测序无信号，然后自己提了质粒去测序也无信号，这是什么原因呢？ 发自小木虫Android客户端 |
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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1、楼主首先要确认挑选的克隆是正确的克隆，菌液pcr验证正确，应该提取质粒，并进行双酶切验证是否真的为阳性克隆。 2、菌液和质粒均没有信号，是不是载体拷贝数较低，楼主提取质粒后有没有进行电泳检测，确认载体浓度高低。 3、测序没有信号，和测序为空载还是两个不同的问题，一方面与载体浓度有关，另一方面楼主要确认选择的测序引物是否合适。 4、有可能测序供公司问题。 解决办法： 1、因为不清楚楼主使用的框架载体是什么载体，是否有通用引物？ 其实楼主可以在构建好T克隆后就进行测序（T载体本身就经常被用来做亚克隆测序），T载体有自己的通用引物，发生没信号的概率比较低。因为你后续是进行酶切亚克隆的，不存在PCR的过程（PCR过程可能导致错配或突变等情况，所以一般要测序验证），发生目标基因突变的可能性较低，即T载体克隆阶段测序结果可以作为你亚克隆后的测序结果（结合双酶切验证结果）。 2、楼主也可以提取重组质粒，并进行双酶切验证，酶切确定为正确的质粒，且质粒浓度OK，可将该质粒作为样品送测序。 同时如果确认之前选择的引物没有问题，那么本次可以尝试寄送 自己的引物作为测序引物，比如你菌落PCR用的引物就可以作为测序用。 3、如果上述方法没办法解决，可以用你的引物对挑选的克隆进行pcr，然后胶回收你的目的条带，将这个回收PCR产物和你自己的引物一同送去测序。 方法还是比困难多，祝好1 |
2楼2021-06-01 17:25:52
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感谢回复，受益良多 我已进行过双酶切验证，是正确的 载体浓度比较低 t载体质粒小提浓度大概60ng T4连接以后小提浓度大概120ng 由于T载体浓度比较低，不好测序，我打算用你说的最后一种方法看看，感谢！ 发自小木虫Android客户端 |
3楼2021-06-01 18:10:49