| 查看: 2727 | 回复: 2 | |||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者黎明之前01将赠送您 5 个金币 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[求助]
载体测序无信号是怎么回事？ 已有1人参与
|
|||
|
我之前用Infusion的方法连接不上，总是连上了两端，中间缺失。然后我就换用T4连接的方法，先连接在T载体上，然后进行菌液PCR，条带正确，提了质粒，双酶切，胶回收后用于T4连接到我的骨架载体上，再进行菌液PCR，条带正确，送菌液测序无信号，然后自己提了质粒去测序也无信号，这是什么原因呢？ 发自小木虫Android客户端 |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有263人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
|
感谢回复，受益良多 我已进行过双酶切验证，是正确的 载体浓度比较低 t载体质粒小提浓度大概60ng T4连接以后小提浓度大概120ng 由于T载体浓度比较低，不好测序，我打算用你说的最后一种方法看看，感谢！ 发自小木虫Android客户端 |
3楼2021-06-01 18:10:49
原海亮
木虫 (著名写手)
- 应助: 232 (大学生)
- 金币: 4607.4
- 散金: 3521
- 红花: 33
- 帖子: 1804
- 在线: 375.4小时
- 虫号: 1392705
- 注册: 2011-09-06
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
|
1、楼主首先要确认挑选的克隆是正确的克隆，菌液pcr验证正确，应该提取质粒，并进行双酶切验证是否真的为阳性克隆。 2、菌液和质粒均没有信号，是不是载体拷贝数较低，楼主提取质粒后有没有进行电泳检测，确认载体浓度高低。 3、测序没有信号，和测序为空载还是两个不同的问题，一方面与载体浓度有关，另一方面楼主要确认选择的测序引物是否合适。 4、有可能测序供公司问题。 解决办法： 1、因为不清楚楼主使用的框架载体是什么载体，是否有通用引物？ 其实楼主可以在构建好T克隆后就进行测序（T载体本身就经常被用来做亚克隆测序），T载体有自己的通用引物，发生没信号的概率比较低。因为你后续是进行酶切亚克隆的，不存在PCR的过程（PCR过程可能导致错配或突变等情况，所以一般要测序验证），发生目标基因突变的可能性较低，即T载体克隆阶段测序结果可以作为你亚克隆后的测序结果（结合双酶切验证结果）。 2、楼主也可以提取重组质粒，并进行双酶切验证，酶切确定为正确的质粒，且质粒浓度OK，可将该质粒作为样品送测序。 同时如果确认之前选择的引物没有问题，那么本次可以尝试寄送 自己的引物作为测序引物，比如你菌落PCR用的引物就可以作为测序用。 3、如果上述方法没办法解决，可以用你的引物对挑选的克隆进行pcr，然后胶回收你的目的条带，将这个回收PCR产物和你自己的引物一同送去测序。 方法还是比困难多，祝好1 |
2楼2021-06-01 17:25:52
5