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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » TA克隆及测序问题
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greatsaint

银虫 (小有名气)

[交流] TA克隆及测序问题

我现在将PCR产物用克隆试剂盒做了TA克隆，将筛选的阳性克隆做菌液PCR，鉴定阳性克隆时用的引物是第一次PCR时的引物，没用试剂盒中克隆载体上的M13F、M13R通用引物，结果没有扩增出来。我以前这么做过并得到了目的片段，不知道这次怎么没有成功。
用载体上的通用引物鉴定和用原引物通过鉴定有差别吗？
我想再问下，这种TA克隆不算是定向克隆吧？那测出来的岂不是正反义链两条单链的序列？如何取舍？
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1楼 2009-08-10 09:02:27
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erictan2046

铜虫 (正式写手)
★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-10 20:35
如果克隆正确的话，用原引物可以P出来的，像我做TA克隆，都是用原引物P来验证的，没用过载体通用引物。
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2楼2009-08-10 11:03:14
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smallcat227

木虫 (著名写手)
★
amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-10 20:35
楼上正解，我们也都是用原引物验证的，可能是假阳性呢，最好还是提取质粒验证，结合酶切
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3楼2009-08-10 13:16:14
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★ ★
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司马诸葛(金币+1,VIP+0): 8-10 16:12
片段上的引物有时候是P不出来的，测序公司偏向于用载体引物测．你要是测通的话就可以反过来比对．如果只测一个反应的话，你觉得插入反向了，可以重新从令一端开始测．
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
4楼2009-08-10 15:55:55
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baiyidao

金虫 (小有名气)
★
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克隆与方向没关系，只要引物对就行，用通用引物比较好，
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5楼2009-08-10 20:29:14
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greatsaint

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by baiyidao at 2009/8/10 20:29:
克隆与方向没关系，只要引物对就行，用通用引物比较好，

如果与方向没关系，用两个通用引物测序得到的是两条链的顺序吧，取哪一个呢？
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6楼2009-08-10 20:33:55
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huanshi

银虫 (小有名气)
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引用回帖:
Originally posted by greatsaint at 2009-8-10 20:33:


如果与方向没关系，用两个通用引物测序得到的是两条链的顺序吧，取哪一个呢？

如果你做的是一个完整的蛋白编码序列的话，取可以翻译出最长的蛋白质的那个。。。
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7楼2009-08-10 21:50:25
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greatsaint

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by huanshi at 2009/8/10 21:50:



如果你做的是一个完整的蛋白编码序列的话，取可以翻译出最长的蛋白质的那个。。。

假如只用一个引物测序，并且测通，但是这个序列并不是编码蛋白质的那条链，这样得到的序列可以提交到Genebank吗？还是根据碱基互补原则得到其互补链的序列后再提交呢？
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8楼2009-08-11 08:13:41
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huanshi

银虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
Originally posted by greatsaint at 2009-8-11 08:13:


假如只用一个引物测序，并且测通，但是这个序列并不是编码蛋白质的那条链，这样得到的序列可以提交到Genebank吗？还是根据碱基互补原则得到其互补链的序列后再提交呢？

一般都是提交编码链吧。。。、

这样你可以对你提交的序列做更多的注释，比如cds什么的。。
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9楼2009-08-11 19:26:02
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