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greatsaint

银虫 (小有名气)

[交流] TA克隆及测序问题

我现在将PCR产物用克隆试剂盒做了TA克隆,将筛选的阳性克隆做菌液PCR,鉴定阳性克隆时用的引物是第一次PCR时的引物,没用试剂盒中克隆载体上的M13F、M13R通用引物,结果没有扩增出来。我以前这么做过并得到了目的片段,不知道这次怎么没有成功。
用载体上的通用引物鉴定和用原引物通过鉴定有差别吗?
我想再问下,这种TA克隆不算是定向克隆吧?那测出来的岂不是正反义链两条单链的序列?如何取舍?
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baiyidao

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
克隆与方向没关系,只要引物对就行,用通用引物比较好,
5楼2009-08-10 20:29:14
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erictan2046

铜虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流! 8-10 20:35
如果克隆正确的话,用原引物可以P出来的,像我做TA克隆,都是用原引物P来验证的,没用过载体通用引物。
2楼2009-08-10 11:03:14
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smallcat227

木虫 (著名写手)


amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流! 8-10 20:35
楼上正解,我们也都是用原引物验证的,可能是假阳性呢,最好还是提取质粒验证,结合酶切
3楼2009-08-10 13:16:14
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
司马诸葛(金币+1,VIP+0): 8-10 16:12
片段上的引物有时候是P不出来的,测序公司偏向于用载体引物测.你要是测通的话就可以反过来比对.如果只测一个反应的话,你觉得插入反向了,可以重新从令一端开始测.
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
4楼2009-08-10 15:55:55
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