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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » qPCR检测限为什么不是拷贝数/反应，而是拷贝数/mL
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xbwwsq

银虫 (小有名气)

[交流] qPCR检测限为什么不是拷贝数/反应，而是拷贝数/mL

目前看到的关于新冠等核酸检测试剂盒标明的检测限都是“拷贝数/mL”，这是怎么测出来的，看了很多文章都说是利用已知浓度的病毒颗粒或质粒十倍稀释后看最低能检测到的拷贝数，并没有写明详细做法。不理解的是，为什么检测限不以“拷贝数/反应”来表示，比如1000拷贝/mL的样品1mL，模板加10μL和1μL肯定是不一样的，所以这个1000拷贝/mL表示一个反应能检测到多少呢。如果我们自己设计qPCR反应，检测限应该达到多少个拷贝/反应才是合适的呢，自己做实验的时候500个拷贝/反应的ct值就已经36了，是哪里的问题呢
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1楼2021-04-12 14:26:38
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山舞银蛇

铁杆木虫 (正式写手)
★
xbwwsq(金币+1): 谢谢参与
cp/ml是以初始样本计算的，做得好的，可以做到100cp/ml。
然后取200μl样本，也就是取到了20个cp，经过核酸提取，回收率一般30~70%，还剩6~14 cp。
洗脱体积50，算上蒸发，剩余30μl 核酸，如果上样20μl，就是4~9 cp。
那么对应PCR部分不计算提取的检出限就是4~9 cp/PCR
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6楼2021-04-25 14:49:10
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xbwwsq

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 山舞银蛇 at 2021-04-25 14:49:10
cp/ml是以初始样本计算的，做得好的，可以做到100cp/ml。
然后取200μl样本，也就是取到了20个cp，经过核酸提取，回收率一般30~70%，还剩6~14 cp。
洗脱体积50，算上蒸发，剩余30μl 核酸，如果上样20μl，就是4~ ...

老师您好，谢谢您的回答，很好奇qPCR真能做到10 copy/反应啊，我平时做实验挺粗放，没有做过这么细。我现在做到500copy/反应的Ct值就已经34、35了，请问这个原因是什么呢，是因为引物设计的不够好吗。我的扩增效率用sybrgreen染料法测，计算下来是90%，应该也还行啊。期待您的回复
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8楼2021-05-19 23:47:33
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山舞银蛇

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by xbwwsq at 2021-05-19 23:52:50
另外，如果这1ml（100cp/ml）的样本全部提取，然后用50ul洗脱，假设蒸发后剩30，上样20ul的话，这样计算下来每个反应是20-50cp/PCR，那么是不是也可以宣称这个试剂检测下限是100cp/ml 呢，这岂不是有点乱套...

不乱套，以cp/ml计算，只管你样本初始浓度，评估的是整套提取+扩增的性能，检出限只要你保证95%以上检出率就行。我之前做HBV检测，600多上样量，做到2 IU/ml（＜12cp/ml，3cp/PCR）就这么做的。
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12楼2021-05-22 08:37:52
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xbwwsq

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 山舞银蛇 at 2021-04-25 14:49:10
cp/ml是以初始样本计算的，做得好的，可以做到100cp/ml。
然后取200μl样本，也就是取到了20个cp，经过核酸提取，回收率一般30~70%，还剩6~14 cp。
洗脱体积50，算上蒸发，剩余30μl 核酸，如果上样20μl，就是4~ ...

另外，如果这1ml（100cp/ml）的样本全部提取，然后用50ul洗脱，假设蒸发后剩30，上样20ul的话，这样计算下来每个反应是20-50cp/PCR，那么是不是也可以宣称这个试剂检测下限是100cp/ml 呢，这岂不是有点乱套
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9楼2021-05-19 23:52:50
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山舞银蛇

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xbwwsq at 2021-05-19 23:47:33
老师您好，谢谢您的回答，很好奇qPCR真能做到10 copy/反应啊，我平时做实验挺粗放，没有做过这么细。我现在做到500copy/反应的Ct值就已经34、35了，请问这个原因是什么呢，是因为引物设计的不够好吗。我的扩增效率 ...

我自己做Taqman方法的，基本都在3~4 cp/PCR，100~1000cp/ml的水平，取决于提取体系、扩增体系的大小。
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11楼2021-05-22 08:34:59
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tzynew2楼
2021-04-12 14:29   回复  
xbwwsq(金币+1): 谢谢参与
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psylhh3楼
2021-04-12 20:48   回复  
xbwwsq(金币+1): 谢谢参与
miaojiabing4楼
2021-04-14 15:12   回复  
xbwwsq(金币+1): 谢谢参与
7
bjdxyxy5楼
2021-04-14 23:02   回复  
xbwwsq(金币+1): 谢谢参与
。 发自小木虫Android客户端
bjdxyxy7楼
2021-04-25 15:24   回复  
bjdxyxy10楼
2021-05-20 11:26   回复  
nono200913楼
2021-10-01 09:14   回复  
xbwwsq(金币+1): 谢谢参与
·
刀劈三关14楼
2021-10-04 21:27   回复  
。
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