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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于smart race 求助
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88196861

铜虫 (小有名气)

[交流] 关于smart race 求助

在利用，clontech 的smart race 做5-race，设计的也是巢式，第一轮反应什么都没有，就有引物二聚体，紧接着我就用试剂盒自带的巢式引物NUP和内部巢式特异引物进行二轮扩增，发现，呈现弥散，我的第一轮反应的特异引物Tm是61度，第二轮特异引物Tm是66度，我两轮pcr的退火温度都是65度，我估计第一轮的退火温度是不是高了，还是我的cDNA第一链合成的有问题。我pcr反应用的是ExTag.不知道是那里的问题希望达人指点

[ Last edited by 88196861 on 2009-8-8 at 17:12 ]
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1楼 2009-08-08 17:10:59
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695

木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
正在做，我用的nest PCR效果不好，没遇到那样情况
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2楼2009-08-08 17:57:06
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michaelwuqingyu

金虫 (正式写手)
很正常,我认为引物设计有问题 重新多设计几对引物 引物是最关键的,提高退火温度
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3楼2009-08-09 12:58:32
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
退火温度是比较高，可以适当的降低一下，个人认为影响不是很大，主要还是CDNA质量的问题，此外在你的5‘端要联上一个引物外加ccc端吧，这个比较重要，完全按照protocol做就可以了，用于pcr的酶保真性一定要高，而且可以扩增长片段，如果CDNA这段中间你要是有引物的话，扩增效率会有所提高。
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会当凌绝顶，一览众山小
4楼2009-08-09 21:14:38
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laojiu9878

至尊木虫 (文坛精英)

九牛
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我看就是CDNA质量的问题，以前做过，退火温度不高
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但愿人长久
5楼2009-08-10 10:22:49
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88196861

铜虫 (小有名气)
希望多多指教
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6楼2009-08-13 14:52:57
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yoyoyehan

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
PCR用的是哪个程序呀，引物的退火温度有点低，clontech 试剂盒提供的程序很好用，我做一次就出来了，祝好运。
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7楼2009-08-14 15:52:47
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88196861

铜虫 (小有名气)
希望大家多多指教啊。我用的是Ex-tag会不会有什么影响呢
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8楼2009-08-22 19:39:04
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fishing2939

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我也在做这个 建议如果你的模板GC含量较高的话可以使用LAtag和GCbuffer 祝你成功
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9楼2009-08-22 22:08:39
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fishing2939

新虫 (初入文坛)
哦还有你第一轮的退火温度低了 尽量大于70度 首轮采用touchdown pcr
首轮的产物要经过稀释再跑第二轮
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10楼2009-08-22 22:12:16
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