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88196861

铜虫 (小有名气)

[交流] 关于smart race 求助

在利用,clontech 的smart race 做5-race,设计的也是巢式,第一轮反应什么都没有,就有引物二聚体,紧接着我就用试剂盒自带的巢式引物NUP和内部巢式特异引物进行二轮扩增,发现,呈现弥散,我的第一轮反应的特异引物Tm是61度,第二轮特异引物Tm是66度,我两轮pcr的退火温度都是65度,我估计第一轮的退火温度是不是高了,还是我的cDNA第一链合成的有问题。我pcr反应用的是ExTag.不知道是那里的问题希望达人指点

[ Last edited by 88196861 on 2009-8-8 at 17:12 ]
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laojiu9878

至尊木虫 (知名作家)

九牛


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我看就是CDNA质量的问题,以前做过,退火温度不高
但愿人长久
5楼2009-08-10 10:22:49
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695

木虫 (职业作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
正在做,我用的nest PCR效果不好,没遇到那样情况
2楼2009-08-08 17:57:06
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michaelwuqingyu

金虫 (正式写手)

很正常,我认为引物设计有问题 重新多设计几对引物 引物是最关键的,提高退火温度
3楼2009-08-09 12:58:32
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
退火温度是比较高,可以适当的降低一下,个人认为影响不是很大,主要还是CDNA质量的问题,此外在你的5‘端要联上一个引物外加ccc端吧,这个比较重要,完全按照protocol做就可以了,用于pcr的酶保真性一定要高,而且可以扩增长片段,如果CDNA这段中间你要是有引物的话,扩增效率会有所提高。
会当凌绝顶,一览众山小
4楼2009-08-09 21:14:38
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