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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 怎样利用两步PCR法进行基因的合成？谢谢
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micro6790

金虫 (小有名气)

[交流] 怎样利用两步PCR法进行基因的合成？谢谢

怎样利用两步PCR法进行基因的合成？
希望大侠们能告诉我这方面的相关知识。

[ Last edited by amisking on 2009-7-30 at 20:04 ]
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1楼 2009-07-30 13:15:53
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anik

银虫 (正式写手)
★
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前面的回复的绝大多数是错误的。这种技术不叫“ 巢式PCR”，正好与之相反，叫做“融合PCR”。
先讲两者不同点：
    巢式PCR：以第一次PCR为模板扩增此模板中的片断，产物大小比第一次PCR产物要小。
    融合PCR：最简单的模型----第一步有两个PCR，第二步以这两个PCR产物为模板（体系中同时加入等量的PCR产物），第二步的产物大小是第一步两个PCR产物大小之和。
此技术的作用：1、去掉目的片断的酶切位点；2、融合两个或多个基因。
在设计引物时需要注意问题：第一步中的两个PCR引物，第一个PCR下游引物与第二个PCR上游引物要有绝大多数的重叠区（这两个引物的长度通常比较长，目前我看到的文献中最长的将近50bp）；第二步PCR的引物需要第一个PCR的上游引物和第二个PCR的下游引物；模板为第一步两个PCR产物（等量）。
当然在设计引物的时候需要考虑这四个引物的GC含量要相当，退火温度要相当。
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12楼2009-07-31 00:01:29
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普通回帖

simpleuc

新虫 (初入文坛)
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司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 7-30 17:51
你说的两部pcr法，是说用巢氏引物扩增吗？
如果是的话通常是，跑完第一轮后，将第一轮产物稀释100倍（有时1000倍，10倍的）作为第二轮pcr的模板，跑第二轮pcr
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2楼2009-07-30 13:54:21
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by simpleuc at 2009-7-30 13:54:
你说的两部pcr法，是说用巢氏引物扩增吗？
如果是的话通常是，跑完第一轮后，将第一轮产物稀释100倍（有时1000倍，10倍的）作为第二轮pcr的模板，跑第二轮pcr

对头!
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3楼2009-07-30 14:29:04
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695

木虫 (职业作家)
呵呵，巢式PCR
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4楼2009-07-30 14:43:31
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hyde0706

木虫 (正式写手)
楼主问的是这个问题吗？如果巢式PCR，直接一步法就行了啊！稀释PCR产物很容易造成污染的。
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5楼2009-07-30 14:58:08
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
基因合成的话第一步应该是组装，第二步是扩增
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6楼2009-07-30 15:47:41
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starlijun

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
如果有一个是小基因，采用引物重叠法就可以
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7楼2009-07-30 16:49:48
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★
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楼主说的是融合 PCR吧,有两个片段,然后用PCR连接起来,是这样么?
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
8楼2009-07-30 16:53:57
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shensc727

金虫 (小有名气)
★
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我的理解和以上大侠不太一样！
我认为两步PCR不是巢氏PCR！一般的PCR反应都是变性-退火-延伸三步组成，如果退火温度和延伸温度比较接近（一般65左右就可以考虑）的话，就可以进行两步PCR反应，即变性-退火（延伸）。退火和延伸放在一起进行！这样的PCR一般都用在退火温度较高，扩增高GC的模板时使用！因为这种PCR主要包括两步，所以叫两步PCR。这是我的理解！
仅供参考！不对之处请各位大侠纠正！谢谢！
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9楼2009-07-30 19:26:58
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microant

银虫 (小有名气)
顶LS~~~~~
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10楼2009-07-30 20:14:28
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