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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 各位帮忙分析一下这张电泳图！
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 各位帮忙分析一下这张电泳图！

最近在做载体构建，是将一个大约1700bp的基因插入到pCAMBIA1301上。首先PCR得到插入片段，片段与载体用Kpn I与BamH I双酶切后连接。然后提质粒。提出质粒来跑电泳。如图：从左到右1--14为提出的质粒。15--22为PCR验证结果。其中15以空载体pCAMBIA1301为模板，16--22模板为连接后载体。最后一道为DL2000 Marker。
    为什么有些质粒才2000bp呢？很郁闷啊！做了很长时间啦，一直没有作出来。今天又出现这种情况。我都快没有信心做下去啦。请各位帮帮分析一下！不胜感激！
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
1楼 2009-07-28 15:08:24
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smallcat227

木虫 (著名写手)
★ ★
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 7-28 22:10
那你的空载也有目的片段啊…

提出的质粒大部分是超螺旋状态的，电泳时比同样大小的线性DNA跑得快，所以显得小，3条带中间一条是比较接近实际质粒大小的
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2楼2009-07-28 15:36:28
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
pCAMBIA 1301有11837bp呢。就是超螺旋状态也不会只有2000bp吧？
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
3楼2009-07-28 15:44:00
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695

木虫 (职业作家)
学习中，我也进行这块的
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4楼2009-07-28 16:43:08
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yangym1123

木虫 (小有名气)
★ ★
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 7-28 22:10
我认为片段没有连接到载体上，要不然以构建后的载体为模板应该可以扩增得到目的条带啊！建议重新做链接，构建成功后测序验证！
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5楼2009-07-28 20:10:40
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smallcat227

木虫 (著名写手)
★
Anson1358(金币+1,VIP+0): 7-29 08:10
引用回帖:
Originally posted by Anson1358 at 2009-7-28 15:44:
pCAMBIA 1301有11837bp呢。就是超螺旋状态也不会只有2000bp吧？

不好意思，外行了……

是啊，超螺旋也不会那么小，你图片中的7-10和13、14是正常质粒是吧，建议做个酶切验证片段是否插入。PCR的话验证的话先保证你的质粒不能被引物结合，不过貌似15也扩增出了相似大小的片段
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6楼2009-07-28 20:14:51
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
amisking(金币+3,VIP+0):欢迎发帖交流！ 7-28 22:11
你提的质粒和PCR是一块跑的吗?这么短时间,质粒怎么跑的这么分散啊
感觉7-10,13,14像是质粒,不过7-10的量也太少了吧
先用酶切检测一下,同时可做一下PCR
你的空载体貌似也有啊,PCR的条件可能有问题,或者试剂有污染,要重新扩一下
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7楼2009-07-28 20:32:32
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 7-28 22:11
Anson1358(金币+1,VIP+0): 7-29 08:11
你这跟随我做的类似,我也在进行中.关键是连接的问题, 在保证基因和载体都完全酶切的情况下,试试不同的连接体系,选用不同的基因和载体比.多连几次看看.一般提出的质粒量是不会这么小的.
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8楼2009-07-28 20:34:43
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w19840308

质粒跑电泳前做双酶切了没有？你怎么判断那条2k的是质粒的带而不是其他？
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9楼2009-07-28 22:01:14
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mascotte

金虫 (正式写手)
我怀疑你电泳图上1-15道的2000bp大小的条带是污染的质粒，也许你的感受态细胞质量有问题，建议你可以先取一支感受态细胞，不加任何质粒，空转化一次涂板检验，工程菌污染是个大问题，这种情况需要提高抗生素浓度。
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10楼2009-07-28 23:03:02
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