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α-葡萄糖苷酶抑制活性实验 已有1人参与
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一、目前在体系优化，遇到的问题是：未出现平台期，每次实验所得数据有一定差距，曲线趋势不统一，无法确定最适酶浓度和底物蔗糖浓度，希望有前辈能提些建议。 二、实验用的方法是： ①0.1M的PBS 70ul和20ul酶混合预热10min,（空白组为不加酶，其他条件皆一致） ②加入20ul蔗糖反应30min， ③加入100ul的0.2M的碳酸钠终止，（以上反应在1.5ml的离心管内完成，与在酶标板内反应所得数据对比而言，前者反应更充分） ④取50ul反应液，往其中加入150ul葡萄糖工作液，再反应15min后酶标仪测OD。 三、但在体系优化这个环节就出现了问题，我参考文献，选取1.0U/ml的酶，加入不同浓度蔗糖（10、20、40、60、80、100、120、140、160mmol/l）但没有平台期，蔗糖60与80这边较平，但160的OD又很高。之后又重复了好几次，但是曲线规律不统一，仍然无法确定最适蔗糖浓度，但文献里又做出来了，不清楚我到底漏了什么细节，希望做过类似实验的前辈能指导一下。（ps先前我增加过终止液的浓度后，发现有平台期，但是测出来的数据太小了，意义不大。) @lifeliuyan 发自小木虫Android客户端 |
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【答案】应助回帖
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茯苓鸭: 金币+5 2021-02-19 21:47:41
茯苓鸭: 金币+5 2021-02-19 21:47:41
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1. 葡萄糖氧化酶法是基于生物催化的方法来测定葡萄糖的含量，受pH的影响，所以试剂盒的说明书里是建议受测样品体积：GOD试液=1：10。在测定抑制剂效力的反应时间到了之后加入碳酸钠会使pH值升高，但你在使用GOD试液的时候却是受测样品体积：GOD试液=1：3，GOD试液自带的缓冲系统不足以抵消样品所带缓冲液的冲击，使GOD的显色反应不能在最适pH进行，建议参考说明书进行。 2.我用过GOD法，是反应时间到了之后沸水浴灭活，受测样品体积：GOD试液=1：10。我也试过加碳酸钠来制止反应，但最终选择了沸水浴。 3.GOD法是有线性范围的，葡萄糖的含量超过一定范围后线性变差，在葡萄糖含量倍增时，增加的读数值小于1倍，并且在葡萄糖含量继续倍增后读数的增幅继续减小。即，假设葡萄糖含量为0、1、2、4、8、16，读数可能为0、1、2、4、7、10，含量为8时已超出该方法的线性范围。线性范围受显色温度和时间影响，要自己摸索，并注意所得结果能够重现。 4.你的步骤描述不全面，抑制剂在哪一步加？你以蔗糖作为α-葡萄糖苷酶的底物？要描述全面才行。 |
6楼2021-01-27 16:58:00
