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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » 预期的链置换信号放大反应没有发生
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小艺ss

新虫 (初入文坛)

[求助] 预期的链置换信号放大反应没有发生 已有1人参与

求助各位大佬，本人在做分子信标识别（MB）和信号放大方面的工作，T是靶标核酸链，B是理论上能将与MB结合的T替换下来，游离的T再次与MB反应，以实现T的量放大的效果。具体步骤如下：
1、MB探针溶于缓冲溶液（10mM Tris-HCl，2mM EDTA，5mM MgCl2），95℃加热5min，缓慢冷却至4℃，得到发夹状MB。B直接溶于缓冲溶液备用（10mM Tris-HCl，2mM EDTA）。
2、取MB于PBS溶液中，37℃孵育30min。测定荧光强度记作F0。
3、取MB和T适量于PBS溶液中，37℃孵育30min。测定荧光强度记作F1。
4、取MB和B适量于PBS溶液中，37℃孵育30min。测定荧光强度记作F2。
5、取MB和T适量于PBS溶液中，37℃孵育30min。取出，加入B探针，37℃孵育30min。测定荧光强度记作F3。
以上反应，MB:T:B为10：1：5。
结果发现荧光强度F0<F1<F2≈F3，理论上F3是明显大于F2的，不知为何，检测到的信号强度没有明显提高。目前推测是链B没有将T置换以致F2与F3相近，不知各位大佬有无别的看法，或者具体一些的建议？
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1楼 2020-11-30 20:14:00
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小艺ss

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2020-12-01 12:19:31
molecular beacon的当量为10，B会优先和游离的过量molecular beacon结合而不会去竞争T，F2就应该约等于F3

那是否建议尝试一下10：1：10？
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3楼2020-12-01 18:30:06
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小艺ss: 金币+5, ★★★很有帮助 2020-12-01 18:29:41
molecular beacon的当量为10，B会优先和游离的过量molecular beacon结合而不会去竞争T，F2就应该约等于F3
赞一下 回复此楼
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2020-12-01 12:19:31
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小艺ss: 金币+2 2020-12-02 15:24:22
３７°Ｃ足够打开ＭＢ么？　能否加热后退火？
赞一下 回复此楼
行至水穷处，坐看云起时
4楼2020-12-01 21:47:56
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