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EAZY丿

新虫 (初入文坛)

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小弟在做一个原核构建，使用了一个特殊载体，载体上MCS只有BamHI和HindIII两个酶切位点，且载体前后是冗长重复的回文序列，不易进行同源重组，因序列里面含有同样的BamHI酶切位点，也无法进行酶切酶连，求助虫友，请问还有什么可行的构建方法吗，谢谢！

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1楼 2020-11-13 10:00:07

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pennchem

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

（1）双酶切目标质粒
（2）根据双酶切后两端序列，重新设计引物PCR靶标序列，使扩增产物与双酶切后质粒两端同源
（3）将切后的质粒与PCR混在一起，然后加入T5外切酶（控制时间和温度）
（4）加入Klenow酶补齐
（5）转化

更简便的方法：

做同义突变，将目的基因中bamHI的位点突变掉

更偷懒的方法：

大量PCR产物后，部分酶切，分离出切了一次和切了两次的PCR产物，然后选长的那个连接