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EAZY丿

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助!已有1人参与

小弟在做一个原核构建,使用了一个特殊载体,载体上MCS只有BamHI和HindIII两个酶切位点,且载体前后是冗长重复的回文序列,不易进行同源重组,因序列里面含有同样的BamHI酶切位点,也无法进行酶切酶连,求助虫友,请问还有什么可行的构建方法吗,谢谢!
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
(1)双酶切目标质粒
(2)根据双酶切后两端序列,重新设计引物PCR靶标序列,使扩增产物与双酶切后质粒两端同源
(3)将切后的质粒与PCR混在一起,然后加入T5外切酶(控制时间和温度)
(4)加入Klenow酶补齐
(5)转化

更简便的方法:

做同义突变,将目的基因中bamHI的位点突变掉

更偷懒的方法:

大量PCR产物后,部分酶切,分离出切了一次和切了两次的PCR产物,然后选长的那个连接
行至水穷处,坐看云起时
2楼2020-11-13 11:47:55
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)


反向扩增载体骨架,通过引物加几个酶切位点上去,然后酶切扩增后的载体,与插入片段链接。

发自小木虫Android客户端
3楼2020-11-13 22:28:00
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