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【悬赏金币】回答本帖问题，作者EAZY丿将赠送您 5 个金币

EAZY丿

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 54.2
帖子: 26
在线: 1小时
虫号: 8606937
注册: 2018-04-23
专业: 微生物生理与生物化学

[求助] 求助！已有1人参与

小弟在做一个原核构建，使用了一个特殊载体，载体上MCS只有BamHI和HindIII两个酶切位点，且载体前后是冗长重复的回文序列，不易进行同源重组，因序列里面含有同样的BamHI酶切位点，也无法进行酶切酶连，求助虫友，请问还有什么可行的构建方法吗，谢谢！

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1楼 2020-11-13 10:00:07

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pennchem

专家顾问 (正式写手)

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专业: 生物大分子结构与功能
管辖: 生物科学

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

（1）双酶切目标质粒
（2）根据双酶切后两端序列，重新设计引物PCR靶标序列，使扩增产物与双酶切后质粒两端同源
（3）将切后的质粒与PCR混在一起，然后加入T5外切酶（控制时间和温度）
（4）加入Klenow酶补齐
（5）转化

更简便的方法：

做同义突变，将目的基因中bamHI的位点突变掉

更偷懒的方法：

大量PCR产物后，部分酶切，分离出切了一次和切了两次的PCR产物，然后选长的那个连接