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 实验技术 |
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zdfang83
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3楼2009-07-23 21:51:38
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MTT原理 MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazan），甲臜的多少可以用酶标仪在570nm 处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT 不会有反应。 MTT 溶液的配制方法 通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。 需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。 实验方法 This procedure is for cells in 96 well plates, if larger plates are used then adjust volumes accordingly. 1. Make a solution of 5mg/ml MTT dissolved in PBS and filter sterilise through a 0.2µM filter and stored at 2-8℃（can be stored for 3 months). 2. 5 hours before the end of the incubation, add 20 µl of MTT solution from step one to each well containing cells. 3. Incubate the plate at 37℃ for 4-5 hours. 4. Remove media with needle and syringe. 5. Add 150 µl(or 200 µl) of DMSO to each well and pipette up and down to dissolve crytals. 6. Put plate into the incubator for 5min to dissovle air bubbles. Transfer to plate reader and measure absorbance at wavelength between 500 and 600 nm(usually 570nm or 550nm). |
2楼2009-07-23 16:31:12
4楼2009-07-24 00:25:16
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