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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 结晶紫染色生物膜
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张瑶0729

新虫 (正式写手)
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结晶紫染色生物膜
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最近课题遇到了问题，我们发现了一株假交替单胞菌，老师让我检测一下产不产生生物膜，我用金黄色葡萄球菌做对照，用96孔板，结晶紫染色，但是每次实验都没有结果。

我的方法是摇菌液，稀释，加入96孔板，培养箱培养24h以后液体移去，PBS.清洗两遍，95％的乙醇固定5min，1％结晶紫染色5min，灭菌蒸馏水清洗3次，干燥后用酶标仪测570nm的OD值，请问是不是方法不对？大家怎么检测产不产生生物膜的

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1楼2020-10-31 13:43:28
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张瑶0729

新虫 (正式写手)
引用回帖:
26楼: Originally posted by 琴小糖 at 2020-11-13 16:17:22
菌液培养后是怎么稀释的？用培养基稀释还是？
96孔板培养后有看到菌液浑浊吗？
我的做法是将用PBS（pH7.3）将各孔冲洗3次，以洗去杂质和未黏附的菌体细胞；各管中已黏附的菌体用2ml 95%（v/v）的甲醇固定15 min， ...

你好，可以加一下好友讨论一下吗？

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28楼2020-11-15 09:19:32
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张瑶0729

新虫 (正式写手)
引用回帖:
27楼: Originally posted by 琴小糖 at 2020-11-13 16:20:11
我是用EP管做的，所以是2ml体系，用96孔板测的话就是200ul体系，96孔板静置培养时间不一定非得是24h，可以看看培养更长时间

用的培养基稀释，可以吗？

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30楼2020-11-17 08:46:00
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琴小糖

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30楼: Originally posted by 张瑶0729 at 2020-11-17 08:46:00
用的培养基稀释，可以吗？
...

用培养基稀释没问题的
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31楼2020-11-17 11:18:53
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琴小糖

银虫 (小有名气)
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38楼: Originally posted by 张瑶0729 at 2020-11-19 17:34:49
你好，我按照你的办法，得出结果，金黄色葡萄球菌的OD值≤ODc值，是不产生生物膜吧？所以并不是所有的金黄色葡萄球菌都会产生生物膜？
...

金黄色葡萄球菌我没怎么研究，我做的是日沟维肠杆菌，是具有产膜能力的，没有用阳性对照，就用培养基不接菌做阴性对照，96孔板培养的时候最好包一下，有点容易干，影响也挺大的
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40楼2020-11-20 12:00:34
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张瑶0729

新虫 (正式写手)
拜托( ??? ? ??? )

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2楼2020-10-31 13:43:36
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biosci

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对照金葡菌产膜了吗

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23楼2020-11-01 07:20:57
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张瑶0729

新虫 (正式写手)
引用回帖:
23楼: Originally posted by biosci at 2020-11-01 07:20:57
对照金葡菌产膜了吗

没有，所以应怎么办呢？步骤是不是哪里不行？

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24楼2020-11-03 08:52:00
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张瑶0729

新虫 (正式写手)
引用回帖:
23楼: Originally posted by biosci at 2020-11-01 07:20:57
对照金葡菌产膜了吗

没有，是技术不对吗？还是？

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25楼2020-11-08 11:10:04
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琴小糖

银虫 (小有名气)
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菌液培养后是怎么稀释的？用培养基稀释还是？
96孔板培养后有看到菌液浑浊吗？
我的做法是将用PBS（pH7.3）将各孔冲洗3次，以洗去杂质和未黏附的菌体细胞；各管中已黏附的菌体用2ml 95%（v/v）的甲醇固定15 min，弃去甲醇，晾干EP管（或直接通风处干燥24h）；用2mL 0.1%（m/v）的结晶紫水溶液染色，15 min后弃去结晶紫染液，用蒸馏水冲洗掉多余染料后再次风干2h。着色于菌体的结晶紫染料用2mL 33%（v/v）的冰醋酸重新溶解，30 min后测定光密度值OD590。
临界ODc值为空白孔平均值加上其3倍的标准差而得到的OD值，根据OD值可将菌株的生物膜形成能力分类如下：OD ≤ ODc（不形成生物膜菌株，（0）），ODc <OD≤ 2 ODc（弱生物膜形成菌株，（+）），2 ODc < OD≤ 4 ODc（中等生物膜形成菌株，（++）  ），OD > 4 ODc（强生物膜形成菌株，（+++））。
冲洗全程越轻柔越好。
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26楼2020-11-13 16:17:22
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琴小糖

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我是用EP管做的，所以是2ml体系，用96孔板测的话就是200ul体系，96孔板静置培养时间不一定非得是24h，可以看看培养更长时间
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27楼2020-11-13 16:20:11
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张瑶0729

新虫 (正式写手)
我用的培养基稀释，可以吗？

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29楼2020-11-17 08:45:39
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张瑶0729

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引用回帖:
31楼: Originally posted by 琴小糖 at 2020-11-17 11:18:53
用培养基稀释没问题的...

请问我买的1％的结晶紫，可以直接用水稀释吗？

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32楼2020-11-17 12:40:13
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琴小糖

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引用回帖:
32楼: Originally posted by 张瑶0729 at 2020-11-17 12:40:13
请问我买的1％的结晶紫，可以直接用水稀释吗？
...

可以
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33楼2020-11-17 13:09:31
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张瑶0729

新虫 (正式写手)
引用回帖:
27楼: Originally posted by 琴小糖 at 2020-11-13 16:20:11
我是用EP管做的，所以是2ml体系，用96孔板测的话就是200ul体系，96孔板静置培养时间不一定非得是24h，可以看看培养更长时间

临界ODc值我没有怎么看懂，怎么加上3倍的标准差？

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34楼2020-11-17 13:22:03
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张瑶0729

新虫 (正式写手)
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26楼: Originally posted by 琴小糖 at 2020-11-13 16:17:22
菌液培养后是怎么稀释的？用培养基稀释还是？
96孔板培养后有看到菌液浑浊吗？
我的做法是将用PBS（pH7.3）将各孔冲洗3次，以洗去杂质和未黏附的菌体细胞；各管中已黏附的菌体用2ml 95%（v/v）的甲醇固定15 min， ...

在问您一个问题，培养时间是不是对他也有影响？

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35楼2020-11-17 15:10:02
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琴小糖

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35楼: Originally posted by 张瑶0729 at 2020-11-17 15:10:02
在问您一个问题，培养时间是不是对他也有影响？
...

有的
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张瑶0729
36楼2020-11-17 16:23:30
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张瑶0729

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36楼: Originally posted by 琴小糖 at 2020-11-17 16:23:30
有的...

临界ODc值我没有怎么看懂，怎么加上3倍的标准差？这个您可以在解释一下吗

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37楼2020-11-17 17:57:52
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张瑶0729

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36楼: Originally posted by 琴小糖 at 2020-11-17 16:23:30
有的...

你好，我按照你的办法，得出结果，金黄色葡萄球菌的OD值≤ODc值，是不产生生物膜吧？所以并不是所有的金黄色葡萄球菌都会产生生物膜？

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38楼2020-11-19 17:34:49
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张瑶0729

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36楼: Originally posted by 琴小糖 at 2020-11-17 16:23:30
有的...

不同的培养基对生物膜有影响吗？

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39楼2020-11-19 17:38:42
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药化荆棘鸟

新虫 (小有名气)
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我也在做生物膜，但数值太大了，结晶紫用的0.1%，而且误差挺大的

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41楼2021-08-30 18:54:26
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xiecj22楼
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