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张瑶0729

新虫 (正式写手)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 577.1
帖子: 545
在线: 54.1小时
虫号: 6762837

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最近课题遇到了问题，我们发现了一株假交替单胞菌，老师让我检测一下产不产生生物膜，我用金黄色葡萄球菌做对照，用96孔板，结晶紫染色，但是每次实验都没有结果。

我的方法是摇菌液，稀释，加入96孔板，培养箱培养24h以后液体移去，PBS.清洗两遍，95％的乙醇固定5min，1％结晶紫染色5min，灭菌蒸馏水清洗3次，干燥后用酶标仪测570nm的OD值，请问是不是方法不对？大家怎么检测产不产生生物膜的

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1楼2020-10-31 13:43:28

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琴小糖

银虫 (小有名气)

应助: 6 (幼儿园)
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在线: 53.8小时
虫号: 10224118

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菌液培养后是怎么稀释的？用培养基稀释还是？
96孔板培养后有看到菌液浑浊吗？
我的做法是将用PBS（pH7.3）将各孔冲洗3次，以洗去杂质和未黏附的菌体细胞；各管中已黏附的菌体用2ml 95%（v/v）的甲醇固定15 min，弃去甲醇，晾干EP管（或直接通风处干燥24h）；用2mL 0.1%（m/v）的结晶紫水溶液染色，15 min后弃去结晶紫染液，用蒸馏水冲洗掉多余染料后再次风干2h。着色于菌体的结晶紫染料用2mL 33%（v/v）的冰醋酸重新溶解，30 min后测定光密度值OD590。
临界ODc值为空白孔平均值加上其3倍的标准差而得到的OD值，根据OD值可将菌株的生物膜形成能力分类如下：OD ≤ ODc（不形成生物膜菌株，（0）），ODc <OD≤ 2 ODc（弱生物膜形成菌株，（+）），2 ODc < OD≤ 4 ODc（中等生物膜形成菌株，（++）），OD > 4 ODc（强生物膜形成菌株，（+++））。
冲洗全程越轻柔越好。