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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » Cas12a-crRNA复合体切割荧光报告分子，最后荧光强度很不稳定，求助！！
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一粒米饭的饭

新虫 (小有名气)

[求助] Cas12a-crRNA复合体切割荧光报告分子，最后荧光强度很不稳定，求助！！ 已有1人参与

Cas12a-crRNA复合体切割荧光报告分子，最后体系中的荧光强度也太不稳定了，求助是哪里出了问题？
具体过程就是先核算恒温扩增，然后cas12a-crRNA复合体识别扩增产物并切割荧光报告分子。
操作在冰上进行，已经尽量控制每管的扩增时间和切割时间相同了。而且我是把其他试剂先混合后再分装与靶标核酸孵育反应的。
最后用qPCR仪测荧光，每次差距都特别大。我做了好多次，取其中最接近的三次结果做了误差棒，如图，还是很差。求助这是怎么回事儿啊？

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1楼 2020-10-12 17:00:11
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一粒米饭的饭

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by junjieshao at 2020-10-13 05:00:06
看不到图，一般情况下误差大，如果排除其他原因，我猜就是信号不够高。就是扩增产物不够多。

不好意思，我也不知道怎么回事总发不了图片，但是荧光强度确实像您讲的那样，不高，高浓度的是500左右，低一点的是200左右。那我再尝试增加扩增时间看看能不能增加一点产物量。或许您了解qPCR仪么，我现在有点怀疑是不是我不应该用qPCR仪来检测这个体系的荧光呀？

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4楼2020-10-13 14:13:50
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junjieshao

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
2楼2020-10-13 05:00:06
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
差别在恒温扩增这一段吧，差异性较大，如果起始靶标浓度高一些，相对结果会稳定一些。
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行至水穷处，坐看云起时
3楼2020-10-13 09:01:05
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一粒米饭的饭

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by pennchem at 2020-10-13 09:01:05
差别在恒温扩增这一段吧，差异性较大，如果起始靶标浓度高一些，相对结果会稳定一些。

对的，就是恒温扩增那一步有差别的。因为我在做灵敏度分析，就想看看最低检测限是多少，但是就结果很不稳定。那我再重复一下高浓度试试看，是我这个体系结果不稳定还是因为靶标浓度低导致信号不稳定。感谢您回复！！

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5楼2020-10-13 14:17:14
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