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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 为什么pk18sacB质粒连接同源片段后转化大肠难以获得转化子
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秦志杰

新虫 (小有名气)

[求助] 为什么pk18sacB质粒连接同源片段后转化大肠难以获得转化子

为什么pk18sacB质粒连接同源片段后转化大肠难以获得转化子
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1楼 2020-08-24 19:48:23
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秦志杰

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wangyuan0929 at 2020-08-25 11:11:01
楼主给出的信息也太少了吧

这个质粒用来敲除，需要先连接上敲除靶基因的上下游同源臂。将pk18酶切或者环p线性化后用Gibson连接这两个同源臂，连接产物转化大肠杆菌要么得到的转化子只有几个，要么一个也没有。没想明白原因。
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3楼2020-08-25 22:32:41
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wangyuan0929

金虫 (小有名气)
楼主给出的信息也太少了吧
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2楼2020-08-25 11:11:01
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wangyuan0929

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 秦志杰 at 2020-08-25 22:32:41
这个质粒用来敲除，需要先连接上敲除靶基因的上下游同源臂。将pk18酶切或者环p线性化后用Gibson连接这两个同源臂，连接产物转化大肠杆菌要么得到的转化子只有几个，要么一个也没有。没想明白原因。...

转化子做过验证吗？里面有没有质粒和目的基因？

转化方法是什么呢？
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4楼2020-08-26 08:44:28
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秦志杰

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wangyuan0929 at 2020-08-26 08:44:28
转化子做过验证吗？里面有没有质粒和目的基因？

转化方法是什么呢？...

偶尔长出的几个转化子提质粒测序是对的。用的是热激转化。应该是这个质粒骨架导致获得的转化子少，将sacB基因连到别的载体骨架转化非常正常。
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5楼2020-08-26 09:25:25
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