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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 酶切连接不成功
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HK驱魔者

铁虫 (正式写手)

[求助] 酶切连接不成功 已有4人参与

酶切连接总是没有阳性子，我的基因是菌p得来的，三个基因，我用overlap连起来总长3900bp，载体是petduet-1，酶切位点ecor1和hind3做了一个多月了，试过各种连接比例。我现在在想会不会是我目的基因有什么问题？

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1楼 2020-08-18 18:12:50
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

实验结果阴性，考虑做阳性对照。

1. 第一个阳性对照，PCR一个短片段（500-1000bp即可），接口酶依然是ecor1和hind3，连接载体依然是petduet-1，如果能连接不成功，说明你整个酶切/连接/转化体系可能有问题。

2. 大片段连接和转化的存在效率问题，你的片段+载体都有9K多了。建议你做一个对照，3900bp的片段 连 T载体（这个长度可能会有连接效率的问题，转化效率不存在瓶颈），如果连接不成功，说明你现在的连接体系对于大片段的效率非常低。如果成功了，你的片段以后就不许需要通过PCR制备了，也会后续的步骤省力。

3. 9K的质粒，热转如果效率不高，考虑换感受态，或者电转。这个要看你自己实验室的技术了，当然也有人会告诉你，9k的质粒一点也不大。

4. 我从来都是不算连接比例的，片段绝对是超量的，就算片段自连也长不出菌。
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12楼2020-08-22 08:42:07
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药学小生

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
多片段连接可用无缝克隆一步与线性化载体构建重组质粒
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2楼2020-08-18 20:01:36
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qaz199018

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼上正解，我们用的诺唯赞的多片段同源重组酶，基本一次成功。（此处不是广告）
赞一下(2人) 回复此楼
~~~
3楼2020-08-18 21:52:54
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junjieshao

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
4楼2020-08-19 04:18:39
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