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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 同源重组连载体，长得菌摇不起来，大神们知道怎么回事么？
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Forzzainter

新虫 (初入文坛)

[交流] 同源重组连载体，长得菌摇不起来，大神们知道怎么回事么？

RT
本人最近在做同源重组连接，将2-3个片段连接到载体上。
连接酶用的是擎科sosoo同源重组连接酶；载体用的是pBI121载体，长度14758bp。
插入的片段大小1100bp左右；酶切位点用的BamH I单酶切，同源臂是擎科的技术给我设计的应该没问题。
载体用TAKARA的快切酶，确认酶切开。
连接时摩尔比按两种形式进行计算。1载体：片段=1:10；2载体：总片段=1:10(即插入两个片段时摩尔比为1:5:5；插入三个片段时摩尔比为1:3:3:3)。
热激法转入感受态，涂板过夜培养12-16h。第二天版上有长菌，但是挑出来的菌都摇不起来，不知是什么原因。
做过pBI121空载的对照，证明感受态，平板以及含抗生素的LB液体都没问题。也排除噬菌体干扰。
有怀疑过是不是因为载体太长的缘故，但还是不太明白明明版上的菌长得很好，为什么摇不起来。按理说同源重组应该长出来的都是阳性菌株，跪求大神解惑。
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1楼 2020-07-25 22:05:46
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腐草为萤8

金虫 (著名写手)

cat
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同学之前也遇到过，重新转化之后好了~

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实验，美食
2楼2020-07-25 22:09:42
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Forzzainter

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 腐草为萤8 at 2020-07-25 22:09:42
同学之前也遇到过，重新转化之后好了~

重转化了，但还是不行。

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3楼2020-07-26 00:01:49
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腐草为萤8

金虫 (著名写手)

cat
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把lb重新配一个吧，我记得当时，我帮同学先挑了一批，很小很小的时候挑的，摇菌长起来了，后来长大一点后，再挑的，就都没长起来，具体是因为什么就不太清楚了

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实验，美食
4楼2020-07-26 07:53:00
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狗狗狗尾巴草

金虫 (小有名气)
★
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平板上长出来的菌落有没有试着做菌落PCR，验证片段是否连接成功？
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5楼2020-07-26 10:29:08
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Forzzainter

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 狗狗狗尾巴草 at 2020-07-26 10:29:08
平板上长出来的菌落有没有试着做菌落PCR，验证片段是否连接成功？

菌落pcr有做，但是做出来的条带和预期的差一些，而且也摇不起来。

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6楼2020-07-26 21:20:07
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Forzzainter

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 腐草为萤8 at 2020-07-26 07:53:00
把lb重新配一个吧，我记得当时，我帮同学先挑了一批，很小很小的时候挑的，摇菌长起来了，后来长大一点后，再挑的，就都没长起来，具体是因为什么就不太清楚了

重连了也摇不起来，lb也重新配了。已经打算换载体了

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7楼2020-07-26 21:21:10
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狗狗狗尾巴草

金虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by Forzzainter at 2020-07-26 21:20:07
菌落pcr有做，但是做出来的条带和预期的差一些，而且也摇不起来。
...

从头验证下引物，模板，酶切位点等是不是有问题吧，建议重新连接。
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8楼2020-07-27 08:55:21
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Forzzainter

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 狗狗狗尾巴草 at 2020-07-27 08:55:21
从头验证下引物，模板，酶切位点等是不是有问题吧，建议重新连接。...

嗯，好的谢谢。已经换载体重新连了。

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9楼2020-07-27 17:14:15
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