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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 载体构建
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凉风晓月

金虫 (小有名气)

[交流] 载体构建

我想把一个5000多的 片段连到一个植物表达载体CAMBIA1300(8000多的)里，做了好几个月了 ，热击电击都试过了，感受态也用了好几个人的，虽然有时长出来过，可抽提质粒后跑电泳，大小都不对。
使用的酶是BamHI 和 HindIII，5000的片段是克隆到T载体上双酶切下来的。1300的多克隆位点和T载体一样，双酶切后，回收（天根的回收试剂盒），连接（开始用的是TAKARA的T4连接酶，后来用Fermantas 的），热击或电击，涂板。
做了N次，怎么都不行，请各位虫子帮帮忙。
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1楼 2009-07-13 15:38:58
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wql1828

木虫 (小有名气)

helix
★
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可能你的片段太长     t载体可能容纳不下那么大！！！
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2楼2009-07-13 15:55:06
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凉风晓月

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流

可能你的片段太长     t载体可能容纳不下那么大！！！

5000的片段做T克隆还是可以的 ，我的问题是5000的片段连到那个植物表达载体上不行。
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3楼2009-07-13 16:03:14
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
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反复调试目的片断和载体片断的连接比例，可以超出此范围1 ：2～10一试。
另外检查下表达载体双酶切回收是否有问题。实在不行，两种酶分开酶切，做两次回收看看。
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Thank-you，so-blue.
4楼2009-07-13 17:03:44
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xiaoyadxy

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
在保证酶切没有问题的情况下，优化连接体系，加大目的片断和载体片断的连接比例。我们以前还用过PEG增大连接效率。
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5楼2009-07-13 17:30:37
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plantst5928

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你回收完没再看看回收的怎么样嘛？天跟的我没用过，我们实验室回收一般是AXYGEN的，效率挺高的。
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6楼2009-08-29 20:47:39
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凉风晓月

金虫 (小有名气)
当然有啊
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7楼2009-08-31 10:11:50
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