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凉风晓月

金虫 (小有名气)

[交流] 载体构建

我想把一个5000多的 片段连到一个植物表达载体CAMBIA1300(8000多的)里,做了好几个月了 ,热击电击都试过了,感受态也用了好几个人的,虽然有时长出来过,可抽提质粒后跑电泳,大小都不对。
使用的酶是BamHI 和 HindIII,5000的片段是克隆到T载体上双酶切下来的。1300的多克隆位点和T载体一样,双酶切后,回收(天根的回收试剂盒),连接(开始用的是TAKARA的T4连接酶,后来用Fermantas 的),热击或电击,涂板。
做了N次,怎么都不行,请各位虫子帮帮忙。
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凉风晓月

金虫 (小有名气)


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可能你的片段太长     t载体可能容纳不下那么大!!!

5000的片段做T克隆还是可以的 ,我的问题是5000的片段连到那个植物表达载体上不行。
3楼2009-07-13 16:03:14
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wql1828

木虫 (小有名气)

helix


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可能你的片段太长     t载体可能容纳不下那么大!!!
2楼2009-07-13 15:55:06
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷


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反复调试目的片断和载体片断的连接比例,可以超出此范围1 :2~10一试。
另外检查下表达载体双酶切回收是否有问题。实在不行,两种酶分开酶切,做两次回收看看。
Thank-you,so-blue.
4楼2009-07-13 17:03:44
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xiaoyadxy

金虫 (小有名气)


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在保证酶切没有问题的情况下,优化连接体系,加大目的片断和载体片断的连接比例。我们以前还用过PEG增大连接效率。
5楼2009-07-13 17:30:37
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